微生物方法學(xué)研究精選(九篇)

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第1篇：微生物方法學(xué)研究范文

關(guān)鍵詞：功能基因組；高通量數(shù)據(jù)；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：Q933 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）10-0190-01

功能基因組學(xué)（后基因組學(xué)），是在結(jié)構(gòu)基因組所提供的豐富的高通量信息資源以及大量各類生成產(chǎn)物的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的基因組學(xué)的子學(xué)科。其通過(guò)在功能基因組水平或功能系統(tǒng)水平上全面地分析基因的功能，發(fā)展和提出了多種實(shí)驗(yàn)手段和分析方法，使得生物學(xué)的研究對(duì)象由單一基因或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)為多個(gè)基因或蛋白質(zhì)組成的系統(tǒng)，進(jìn)而得到關(guān)于基因表達(dá)、調(diào)控、功能以及生物的生長(zhǎng)、發(fā)育的相關(guān)規(guī)律。

1 差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT―PCR）技術(shù)是由Liang和Pardee等提出的，以PCR和聚丙烯酞胺凝z電泳為基礎(chǔ)的功能基因組學(xué)的傳統(tǒng)方法。該方法的基本原理是：以1對(duì)細(xì)胞（或組織） 的總RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA為模板，利用PCR的高效擴(kuò)增，通過(guò)5’端和3’端引物的合理設(shè)計(jì)和組合，將細(xì)胞（或組織） 中表達(dá)的基因片段直接顯示在DNA測(cè)序膠上，從而找出1對(duì)細(xì)胞（或組織）中表達(dá)有差異的cDN斷。DDRT―PCR具有周期短，功能多，靈敏度高，所需RNA的量較少并且重復(fù)性較高等優(yōu)點(diǎn)。但是，在實(shí)際施行過(guò)程中， DDRT―PCR技術(shù)存在著假陽(yáng)性率高、凝膠中單條cDNA帶成分不均一、所獲cDNA僅代表mRNA 3’UTR（非翻譯區(qū)）、一些低拷貝數(shù)mRNA不能有效呈現(xiàn)等問(wèn)題。[1]

2 基因表達(dá)序列分析

基因表達(dá)序列分析（SAGE）是Velculescu等人建立的一種快速高效地分析轉(zhuǎn)錄物的實(shí)驗(yàn)方法。其理論依據(jù)是：基因組中95%的基因可以由來(lái)自cDNA 3’端特定位置的一段9―11bp長(zhǎng)的序列加以區(qū)分。這一段特異的基因序列被記作SAGE標(biāo)簽?；虮磉_(dá)序列分析通過(guò)對(duì)cDNA制備SAGE標(biāo)簽，然后將這些標(biāo)簽串聯(lián)起來(lái)并對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，可以顯示出各SAGE標(biāo)簽所代表的基因在特定的組織中是否有表達(dá)，同時(shí)還可以將SAGE標(biāo)簽所出現(xiàn)的頻率作為其所代表的基因表達(dá)程度的指標(biāo)。但是，應(yīng)用SAGE技術(shù)有一個(gè)重要前提條件：GenBank中必須有某一物種足夠多的DNA序列的資料（特別是EST序列的資料）。[2]

3 微陣列分析

DNA微陣列（microarray assay）技術(shù)包括cDNA微陣列和DNA芯片（DNA chip）兩種方法，這兩種方法的原理相同。首先是在固相表面合成成千上萬(wàn)個(gè)寡核苷酸“探針”（cDNA、EST或基因特異的寡核苷酸），該過(guò)程會(huì)用到光導(dǎo)化學(xué)合成、照相平版印刷和固相表面化學(xué)合成等技術(shù)。接著將寡核苷酸“探針”與來(lái)自不同細(xì)胞、組織或整個(gè)器官的用放射性同位素或熒光物標(biāo)記的DNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA進(jìn)行雜交。最后對(duì)每個(gè)雜交點(diǎn)進(jìn)行定量分析。定量分析的結(jié)果可以用于DNA測(cè)序、DNA突變和多態(tài)性分析以及對(duì)同一組織細(xì)胞在不同狀態(tài)下或在同一狀態(tài)下多種組織細(xì)胞基因表達(dá)水平的差異的檢測(cè)，還可以發(fā)現(xiàn)新的致病基因或疾病相關(guān)基因等。微陣列分析的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)對(duì)大量的基因，甚至是整個(gè)基因組的基因表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析，并且在核苷酸雜交技術(shù)的各個(gè)方面應(yīng)用。其在同時(shí)比較同一組織在不同狀態(tài)下或各組織之間DNA序列分析以及基因的表達(dá)狀況等方面具有極大的優(yōu)越性。

4 反義RNA分析

反義RNA是能與靶RNA互補(bǔ)配對(duì)的，用來(lái)定點(diǎn)分析某一段DN段（基因）功能的小分子RNA。反義RNA分析即是利用反義RNA來(lái)進(jìn)行功能基因組分析的方法。該方法首先分離基因片段的mRNA，合成其mRNA的互補(bǔ)RNA（反RNA）。然后給反RNA加上基因表達(dá)必需的元件（如啟動(dòng)子等），接著插入T-DNA。將其轉(zhuǎn)化到植株中，那么合成的基因就會(huì)在植株中表達(dá)，并表現(xiàn)出相應(yīng)性狀。因?yàn)榉戳xRNA與靶RNA堿基配對(duì)的結(jié)合方式，反義RNA可以在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上對(duì)基因表達(dá)加以調(diào)控。

5 蛋白質(zhì)組分析

蛋白質(zhì)組分析方法主要涉及兩個(gè)步驟：蛋白質(zhì)的分離和蛋白質(zhì)的鑒定。用于蛋白質(zhì)分離的技術(shù)主要是雙向凝膠電泳（2-dimensional gel electrophoresis，2-DE），其原理是細(xì)胞抽提物在電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)個(gè)體首先依據(jù)所帶電荷然后依據(jù)分子大小被分離。這種方法的最大缺點(diǎn)是重復(fù)性差，使得幾乎不能同來(lái)自其他實(shí)驗(yàn)室的資料進(jìn)行比較。

6 生物信息學(xué)

生物信息學(xué)將DNA和蛋白質(zhì)作為研究對(duì)象，以計(jì)算機(jī)等計(jì)算工具為基礎(chǔ)，發(fā)展更新各種軟件，收集、整理和儲(chǔ)存DNA和蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，并加以分析進(jìn)而發(fā)現(xiàn)藏在基因序列中的規(guī)律。應(yīng)用生物信息學(xué)可以對(duì)功能基因組研究過(guò)程中產(chǎn)生的高通量，高維度的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，應(yīng)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法，以計(jì)算機(jī)的快速運(yùn)算能力，找到功能基因組的相關(guān)信息。常應(yīng)用生物信息學(xué)將未知DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中收集的DNA序列進(jìn)行同源性比較，或應(yīng)用相關(guān)軟件進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列的同源性比較，以此來(lái)獲得未知DNA序列的功能信息。[3]

7 小結(jié)與展望

隨著發(fā)展，基因組學(xué)由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)向功能基因組學(xué)發(fā)展，由此也產(chǎn)生了大量應(yīng)用于功能基因組研究的工具和方法。這些方法從不同的角度和方向挖掘基因本身蘊(yùn)含的豐富信息資源。功能基因組學(xué)無(wú)論是應(yīng)用于獲取大量基因功能信息，亦或是針對(duì)特定基因的研究都取得了突破性的進(jìn)展，發(fā)展速度迅速。但隨著各類研究的不斷深入進(jìn)行，這些方法的精確性和準(zhǔn)確性會(huì)漸漸不再滿足條件，同時(shí)各項(xiàng)技術(shù)尚未解決的一些問(wèn)題也會(huì)被放大，單個(gè)方法或技術(shù)可能難以對(duì)新的問(wèn)題有較好的應(yīng)用。結(jié)合各種方法，揚(yáng)長(zhǎng)避短，綜合應(yīng)用各種技術(shù)可以對(duì)功能基因組有更全面、深入的研究。[4]

功能基因組學(xué)的應(yīng)用十分廣泛，從動(dòng)物、植物到微生物群落分析都可以取得較好的研究成果，也可以應(yīng)用于醫(yī)藥、毒理等領(lǐng)域。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，將生物信息學(xué)應(yīng)用于功能基因組學(xué)，借助計(jì)算機(jī)強(qiáng)大的計(jì)算能力，功能基因組學(xué)將能取得更大的突破。

參考文獻(xiàn)

[1]趙錦榮，閻小君，蘇成芝.差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù)研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27（1）：28-32.

[2]常青山，余增亮.基因表達(dá)分析方法及其研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2002，（6）：27-31.

第2篇：微生物方法學(xué)研究范文

1 昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，云南昆明650100； 2 昆明醫(yī)科大學(xué)，云南昆明650500；3 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650224

【摘要】目的：建立燈盞花乙素苷元的微生物限度檢查方法。方法：按照《中國(guó)藥典》2010版要求，采用常規(guī)法對(duì)代表性的細(xì)菌、霉菌、酵母菌進(jìn)行回收率測(cè)定，并對(duì)控制菌檢查法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果：采用常規(guī)法，5種試驗(yàn)菌的回收率均大于70%。結(jié)論：可采用常規(guī)法對(duì)燈盞花乙素苷元進(jìn)行微生物限度檢查。

關(guān)鍵詞 燈盞花乙素苷元；微生物限度檢查；方法學(xué)驗(yàn)證

【中圖分類號(hào)】R927 11【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517(2015)01-0032-02

燈盞花乙素苷元又名野黃芩素，是燈盞花乙素在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，具有抗血栓、抑制血小板聚集、增加腦血管血流量等藥理活性，其生物活性是燈盞花乙素的5倍以上［1］。燈盞花乙素苷元天然存在于燈盞花等植物中，但含量極低，不到萬(wàn)分之一。我們以燈盞花素（主要成分為燈盞花乙素）為原料，采用人工半合成方法實(shí)現(xiàn)了燈盞花乙素苷元的批量生產(chǎn)［2］。本文旨在按照中國(guó)藥典的要求［3］，建立燈盞花乙素苷元的微生物限度檢查方法。

1儀器與材料

1 1儀器HTY-2000A集菌儀（杭州高得醫(yī)療器械有限公司）；開(kāi)放式集菌器（北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司）；303-6B隔水式恒溫培養(yǎng)箱（南通科學(xué)儀器廠）；霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公）。

1 2供試樣品燈盞花乙素苷元（批號(hào)：201208025、20120826、20120827，昆明制藥集團(tuán)股份有限公司藥物研究院）。

1 3培養(yǎng)基改良馬丁液體培養(yǎng)基（批號(hào)：120327）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：120319）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：120207）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：120122）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：111225）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號(hào)：120415）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養(yǎng)基（批號(hào)120622）均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供。

1 4菌種枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis ［CMCC(B)63501］、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ［CMCC(B)26003］、大腸埃希菌Escherichia coli ［CMCC(F)44102］、白色念珠菌Candida albicans ［CMCC(F)98001］、黑曲霉Aspergillus niger ［CMCC(F)98003］均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

2實(shí)驗(yàn)方法

2 1菌液制備分別接種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于32～35℃培養(yǎng)24 h，用0 9%的無(wú)菌氯化鈉溶液以10倍稀釋法稀釋至10-5～10-7，制成每1ml含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液備用。

接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于24～26℃培養(yǎng)48 h，用0.9%的無(wú)菌氯化鈉溶液以10倍稀釋法稀釋至10-4～10-6，制成每1 ml含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液備用。

取黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，于24～26℃培養(yǎng)7 d，用5ml 0 9%的無(wú)菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，取洗脫液以10倍稀釋法稀釋至10-4～10-6，制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液備用。

2 2供試液制備取供試樣品10g于滅菌容器中，加入pH7 0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml，混勻，得1∶10的供試液備用。

2 3菌落計(jì)數(shù)方法及驗(yàn)證

2 3 1菌落計(jì)數(shù)方法采用常規(guī)法對(duì)細(xì)菌、霉菌及酵母菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，通過(guò)回收率測(cè)定進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證［3］。

2 3 2回收率測(cè)定試驗(yàn)組：取1∶10供試液1ml、含50~100cfu試驗(yàn)菌的菌液1ml加入平皿中，5種試驗(yàn)菌每種菌平行制備2個(gè)平皿。在加有枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌菌液的平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，于32～35℃培養(yǎng)48 h，觀察記錄菌落數(shù)；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，于24～26℃培養(yǎng)72 h，觀察記錄菌落數(shù)。

菌液組：取含50~100cfu試驗(yàn)菌的菌液1ml加入平皿中，5種試驗(yàn)菌每種菌平行制備2個(gè)平皿。在加有枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌菌液的平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，于32～35℃培養(yǎng)48 h，觀察記錄菌落數(shù)；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，于24～26℃培養(yǎng)72 h，觀察記錄菌落數(shù)。

供試品對(duì)照組：取1∶10供試液1ml加入平皿中，共制備10個(gè)平皿。在5個(gè)平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，于32～35℃培養(yǎng)48 h，觀察記錄菌落數(shù)；在另外5個(gè)平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，于24～26℃培養(yǎng)72 h，觀察記錄菌落數(shù)。

回收率計(jì)算方法：試驗(yàn)組的菌回收率（%）=（試驗(yàn)組菌落數(shù)平均值-供試品對(duì)照組菌落數(shù)平均值）/菌液組菌落數(shù)平均值×100%。

2 4控制菌（大腸埃希菌）檢查方法及驗(yàn)證

2 4 1控制菌檢查方法采用常規(guī)法對(duì)控制菌大腸埃希菌進(jìn)行檢查。

2 4 2控制菌檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)組：取1∶10供試液10ml，含50~100 cfu大腸埃希菌的菌液1ml，加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于32～35℃培養(yǎng)24h。

陽(yáng)性對(duì)照組：取含50~100cfu大腸埃希菌的菌液1ml，加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于32～35℃培養(yǎng)24h。

陰性菌對(duì)照組：取1∶10供試液10ml，含50~100 cfu金黃色葡萄球菌的菌液1ml，加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于32～35℃培養(yǎng)24h。

供試品對(duì)照組：取1∶10供試液10ml，加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于32～35℃培養(yǎng)24h。

檢查方法：分別取上述試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性菌對(duì)照組和供試品對(duì)照組的培養(yǎng)物0 2 ml接種至裝有5ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，32～35℃培養(yǎng)24h，在366nm紫外線下觀察，若管內(nèi)培養(yǎng)物出現(xiàn)熒光，為MUG熒光陽(yáng)性；否則，為MUG熒光陰性。觀察后滴加靛基質(zhì)試液，若液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；若液面顏色無(wú)變化，為靛基質(zhì)陰性。

3結(jié)果

由表1可見(jiàn)，采用常規(guī)法驗(yàn)證，枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率均大于70%，說(shuō)明燈盞花乙素苷元對(duì)上述5種菌株無(wú)明顯抑制作用。由表2可知，燈盞花乙素苷元的控制菌檢查可按常規(guī)法進(jìn)行。

4討論

燈盞花乙素苷元為人工半合成，不同生產(chǎn)工藝下得到的燈盞花乙素苷元產(chǎn)品，其所含雜質(zhì)或溶劑殘留成分往往不盡相同，其抑菌行為或抑菌作用的強(qiáng)弱程度也往往不同。因此，當(dāng)燈盞花乙素苷元生產(chǎn)工藝或方法發(fā)生變動(dòng)時(shí)，應(yīng)對(duì)產(chǎn)品的微生物限度檢查方法進(jìn)行重新驗(yàn)證。微生物限度檢查是藥品質(zhì)量檢查的重要內(nèi)容。在人工合成藥物的研制過(guò)程中，一些研究機(jī)構(gòu)或研究人員往往只注重產(chǎn)品本身的化學(xué)成分質(zhì)量研究，而忽視或根本不進(jìn)行產(chǎn)品的微生物限度檢查或方法學(xué)研究，這是不科學(xué)、不合理的。按照《中國(guó)藥典》的要求，應(yīng)對(duì)用于非規(guī)定滅菌制劑的合成原料藥進(jìn)行微生物限度檢查及方法學(xué)驗(yàn)證，檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。

燈盞花乙素苷元對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉菌5種菌株無(wú)明顯抑制作用，可采用常規(guī)法對(duì)其進(jìn)行微生物限度檢查。

參考文獻(xiàn)

［1］車慶明，潘麗怡，陳穎，等．燈盞花乙素苷元的藥動(dòng)學(xué)研究［J］．中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42(18)：1418-1421.

［2］周榮光，晏澤宇，趙加強(qiáng)，等．野黃芩素的制備、純化與結(jié)構(gòu)表征［J］．光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28(5)：2403-2406.

第3篇：微生物方法學(xué)研究范文

【摘要】 論述了體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)的目標(biāo)和教學(xué)特點(diǎn)，強(qiáng)調(diào)了實(shí)驗(yàn)規(guī)范操作的重要性，突出了探索性、方法學(xué)研究和掌握是教學(xué)的核心目標(biāo)，提出重視實(shí)驗(yàn)教學(xué)與相關(guān)學(xué)科理論知識(shí)相結(jié)合的教學(xué)要求。初步探討了體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)的教學(xué)思路。

【關(guān)鍵詞】 體內(nèi)藥物分析；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

Abstract:This paper analyzes the teaching goals and characteristics of Biopharmaceutical Analysis experimentation. Emphasis is laid on the significances of canonical operation， focusing on the objectives of exploration， methodology and mastery， demanding the combination of experimentation teaching with correlative subjects of medicine， and offering a brief education consideration for the Biopharmaceutical Analysis experimentation teaching.

Key words:biopharmaceutical analysis;experiment teaching

體內(nèi)藥物分析（biopharmaceutical analysis）是一門(mén)研究生物機(jī)體中藥物及其代謝物和內(nèi)源性物質(zhì)的質(zhì)與量變化規(guī)律的分析方法學(xué)，通過(guò)分析的手段了解藥物在體內(nèi)（包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等機(jī)體）數(shù)量與質(zhì)量的變化，獲得各種藥物代謝動(dòng)力學(xué)的各種參數(shù)和轉(zhuǎn)變、代謝的方式、途徑等信息［1］。體內(nèi)藥物分析是一門(mén)理論與實(shí)際緊密相聯(lián)的學(xué)科，實(shí)驗(yàn)是提高學(xué)生分析問(wèn)題、解決問(wèn)題能力，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)科研作風(fēng)的必不可少的教學(xué)環(huán)節(jié)。體內(nèi)藥物分析不只著眼于體外藥物質(zhì)量，更注重研究和了解藥物在生物體內(nèi)的表現(xiàn)。因此，體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)不能看作簡(jiǎn)單的技能訓(xùn)練和培養(yǎng)，更不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為藥學(xué)生開(kāi)設(shè)了藥物分析實(shí)驗(yàn)就可以忽視或省略體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)課。體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)課應(yīng)是理論課的重要組成部分，體內(nèi)藥物分析的任務(wù)和特點(diǎn)應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)課中得到充分體現(xiàn)。我們結(jié)合自身教學(xué)實(shí)踐， 對(duì)體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)的教學(xué)內(nèi)容和方法進(jìn)行了一系列探索和改進(jìn)，并有所心得。

一、明確教學(xué)目標(biāo)和把握教學(xué)特點(diǎn)

體內(nèi)藥物分析是一門(mén)實(shí)踐性很強(qiáng)的課程，體內(nèi)藥物分析的教學(xué)目標(biāo)是（1）學(xué)生加深對(duì)體內(nèi)藥物分析基本理論和專業(yè)知識(shí)的理解，為從事臨床藥學(xué)研究奠定基礎(chǔ)；（2）熟悉生物樣本分析方法的建立步驟和方法驗(yàn)證的內(nèi)容與要求；(3) 掌握生物樣本預(yù)處理方法的特點(diǎn)及其應(yīng)用；（4）了解藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算。因此，主要的教學(xué)目標(biāo)還是靠實(shí)驗(yàn)教學(xué)來(lái)實(shí)現(xiàn)。而且，隨著時(shí)代的進(jìn)步和發(fā)展，從事新藥研制和開(kāi)發(fā)工作的要求以及藥動(dòng)學(xué)、生物藥劑學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、臨床藥學(xué)服務(wù)的水平的需要使得社會(huì)對(duì)藥學(xué)學(xué)生的要求越來(lái)越高。提高應(yīng)用現(xiàn)代體內(nèi)藥物分析技術(shù)的能力，使藥學(xué)生真正適應(yīng)藥學(xué)事業(yè)現(xiàn)實(shí)工作和未來(lái)發(fā)展的需要是社會(huì)提出的新的教學(xué)目標(biāo)。

雖然體內(nèi)藥物分析的實(shí)驗(yàn)原理與藥物分析的原理相同，但是教學(xué)方式和方法兩者不能等同，體內(nèi)藥物分析的實(shí)驗(yàn)教學(xué)應(yīng)該有自己的教學(xué)特點(diǎn)的。首先，教學(xué)目標(biāo)的不同，藥物分析實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)學(xué)生的基本技能訓(xùn)練和實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范，而體內(nèi)藥物分析的實(shí)驗(yàn)教學(xué)更強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的傳授。所以，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上驗(yàn)證性的實(shí)驗(yàn)少，綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)多；課堂上老師講解少，學(xué)生集體討論多；對(duì)學(xué)生方法的掌握、思維的引導(dǎo)關(guān)注多，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的強(qiáng)調(diào)少。其次，由于各種分析技術(shù)是體內(nèi)藥物分析學(xué)科的支柱，一些代表體內(nèi)藥物分析領(lǐng)域最活躍的前沿技術(shù)如液質(zhì)聯(lián)用（LCMS）、高效毛細(xì)管電泳法（CE）、液相色譜－核磁共振聯(lián)用技術(shù)（LCNMR）應(yīng)用于體內(nèi)藥物分析越來(lái)越活躍和成熟，這些代表分析技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，應(yīng)該多采用播放教學(xué)錄像、多媒體教學(xué)等多種教學(xué)手段；也可帶領(lǐng)學(xué)生到科研單位、醫(yī)院參觀、示教體內(nèi)藥物分析的方法及先進(jìn)的儀器設(shè)備［2］。

二、強(qiáng)化操作的嚴(yán)格和規(guī)范

體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)主要是干擾雜質(zhì)多。生物樣品中除了所含的待測(cè)藥物及其代謝藥物外，通常還會(huì)有大量的內(nèi)源性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪、尿素、色素等有機(jī)雜質(zhì)以及鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、銅等無(wú)機(jī)雜質(zhì)。同時(shí)這些內(nèi)源性物質(zhì)還可能與藥物及代謝藥物結(jié)合產(chǎn)生新的物質(zhì)。因此，生物樣品一般需經(jīng)分離凈化，排除干擾后才能進(jìn)行測(cè)定。體內(nèi)樣品需經(jīng)適當(dāng)處理，才能用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行分析。提取的方法有很多，如直接沉淀蛋白法、液－液萃取法、固相萃取法、膜過(guò)濾法等。提取是關(guān)鍵，提取的好壞直接決定結(jié)果的正確與否。然而，相比于藥物分析的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，體內(nèi)藥物分析提取步驟多，操作復(fù)雜、所用到的儀器多、耗時(shí)較長(zhǎng)，往往增大了學(xué)生們操作失誤的可能。同學(xué)們做出來(lái)的結(jié)果也容易五花八門(mén)，由于提取步驟多，實(shí)驗(yàn)失敗的原因也難以分析。提取的工作多為一環(huán)扣一環(huán)的，當(dāng)有的學(xué)生提取的后期出現(xiàn)較明顯的失誤時(shí)，會(huì)使得實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行下去。我們以體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)“差示分光光度法測(cè)定血漿中水楊酸濃度”實(shí)驗(yàn)教學(xué)為例：血漿樣品的前處理經(jīng)歷了酸化、二氯甲烷萃取、離心、棄去上清、堿化提取、超聲除氣泡等步驟，同比于藥物分析實(shí)驗(yàn)“差示分光光度法測(cè)定維生素B1片的含量”，樣品提取只有經(jīng)歷了過(guò)濾，而兩者的分析方法均為標(biāo)準(zhǔn)曲線法和差示分光光度法。由此可見(jiàn)，扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)操作技能是體內(nèi)藥物分析的基礎(chǔ)，而嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作和規(guī)范是體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)取得成效的保證。

三、注重方法學(xué)的分析和掌握

當(dāng)然體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)開(kāi)展的目的不是簡(jiǎn)單的為了讓學(xué)生掌握基本的藥典操作規(guī)范以及實(shí)驗(yàn)基本技能。體內(nèi)藥物分析是一門(mén)實(shí)踐性很強(qiáng)的課程，并沒(méi)有現(xiàn)成的方法去照搬。所以，體內(nèi)藥物分析的分析方法的建立和評(píng)價(jià)是實(shí)驗(yàn)課程的重點(diǎn)。體內(nèi)藥物分析重視方法的專屬性、選擇性、靈敏度，因此也一般選擇儀器分析方法。并且分析方法應(yīng)該從樣品的種類、樣品中待測(cè)物的濃度、待測(cè)物的穩(wěn)定性、檢測(cè)儀器的種類、待測(cè)物的檢測(cè)方式等方面進(jìn)行綜合考慮。如“阿奇霉素制劑生物等效性”實(shí)驗(yàn)過(guò)程中［3］， 血樣中阿奇霉素的濃度范圍為5 ng/mL～1 μg/ mL， 其檢測(cè)方法可采用HPLC法、LCMS 法和微生物法等數(shù)種方法， 若用HPLC法來(lái)檢測(cè)該樣品， 由于阿奇霉素的紫外吸收較弱， 必須對(duì)樣品進(jìn)行富集濃縮， 則樣品的前處理方法采用液－液萃取法為佳; 若用LCMS法來(lái)檢測(cè)該樣品， 則由于LCMS儀器的靈敏度足以檢測(cè)濃度為1 ng/mL以上的樣品， 故樣品的前處理只需采用蛋白沉淀法即可; 若用微生物法來(lái)檢測(cè)該樣品， 則樣品連蛋白也不需沉淀， 直接上樣即可。蛋白沉淀是體內(nèi)藥物分析的血樣處理關(guān)鍵步驟。蛋白沉淀法中高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但從樣品的穩(wěn)定性角度考慮，阿奇霉素遇酸不穩(wěn)定， 故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法，如果測(cè)定的是血清中頭孢拉定的濃度， 頭孢拉定為β內(nèi)酰胺類抗生素，對(duì)酸穩(wěn)定，且酸有利于頭孢拉定的提取，蛋白沉淀法的選擇就要采用高氯酸沉淀法了。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中，這種方法學(xué)的建立和樣品前處理方法的取舍才是老師傳授的主題和學(xué)生需要重點(diǎn)理解的。以上例子不但說(shuō)明了方法學(xué)的建立選擇的重要性，也給出了體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)課的一條基本教學(xué)思路－注重方法學(xué)的分析和掌握。

四、重視實(shí)驗(yàn)與相關(guān)學(xué)科的理論知識(shí)相結(jié)合

在體內(nèi)藥物分析中，被測(cè)物處于復(fù)雜的生物介質(zhì)中，濃度呈微量、動(dòng)態(tài)變化。而且藥物在體內(nèi)經(jīng)過(guò)吸收、分布、代謝、排泄過(guò)程。這時(shí)各種分析的技術(shù)只是實(shí)驗(yàn)實(shí)踐的工具，最終是為了藥動(dòng)學(xué)、生物藥劑學(xué)、臨床藥學(xué)、及新藥開(kāi)發(fā)服務(wù)。體內(nèi)藥物分析必須與相關(guān)學(xué)科的理論知識(shí)相結(jié)合。如臨床藥理研究，常需進(jìn)行血藥濃度的測(cè)定，以了解血藥濃度與藥物效應(yīng)之間的關(guān)系。如臨床藥學(xué)研究，常需進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM），提供準(zhǔn)確的血藥濃度測(cè)定值，以實(shí)行給藥方案?jìng)€(gè)體化。在新藥研制過(guò)程中，按照國(guó)家新藥審批的有關(guān)規(guī)定，應(yīng)提供藥物在動(dòng)物和人體內(nèi)的有關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如血藥濃度的峰值、達(dá)峰濃度的時(shí)間、藥－時(shí)曲線下面積、表現(xiàn)分布容積、半衰期、生物利用度、腎清除率以及血漿蛋白結(jié)合率等基本數(shù)據(jù)。另外還要了解藥物代謝產(chǎn)物學(xué)科和體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)等相關(guān)知識(shí)［4］?？傊?，體內(nèi)藥物分析也是一門(mén)綜合性很強(qiáng)的學(xué)科，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)踐過(guò)程中，一定要體現(xiàn)出體內(nèi)藥物分析與其他學(xué)科的交叉和融合。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上應(yīng)增加分析后的藥動(dòng)、藥代、生物量效以及與臨床相關(guān)指標(biāo)的分析，盡量與實(shí)際學(xué)生今后的實(shí)習(xí)、工作實(shí)踐接軌，拓寬學(xué)生的思路，提高分析問(wèn)題解決問(wèn)題的能力。

總之，開(kāi)展體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)課教學(xué)時(shí)要明確教學(xué)目標(biāo)和把握教學(xué)特點(diǎn)，探索本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)理念，我們認(rèn)為嚴(yán)格規(guī)范的操作是實(shí)驗(yàn)教學(xué)的基本保證也是最低要求，分析方法的建立和評(píng)價(jià)是實(shí)驗(yàn)教學(xué)的核心也是教學(xué)主要目標(biāo)，實(shí)驗(yàn)實(shí)踐與相關(guān)學(xué)科的理論知識(shí)的結(jié)合是實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)的需要也是教學(xué)與實(shí)踐的必然要求。

【參考文獻(xiàn)】

［1］李好枝. 主編. 體內(nèi)藥物分析［M］. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2004.

［2］石娟， 陳慧娟， 楊群英. 藥學(xué)專業(yè)應(yīng)開(kāi)設(shè)體內(nèi)藥物分析實(shí)驗(yàn)課［J］. 藥學(xué)教育， 2000，16 （3）:30-31.

第4篇：微生物方法學(xué)研究范文

關(guān)鍵詞：淋病奈瑟菌感染 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 研究 現(xiàn)狀

【中圖分類號(hào)】R-0 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1671-8801（2013）10-0069-02

淋病是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高的性疾病之一，它是由淋病奈瑟菌導(dǎo)致的一種泌尿生殖系統(tǒng)炎性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要為：傳染、尿道感染等，該疾病能夠?qū)χ蹦c、眼角膜或咽喉部造成傷害，對(duì)女性來(lái)講更會(huì)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎，并導(dǎo)致不孕不育；男性患者則容易造成前列腺炎等[1]。除此以外，該疾病還能引發(fā)關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等癥狀，對(duì)患者的危害極大。

及時(shí)對(duì)淋病奈瑟菌進(jìn)行診斷非常重要，它有助于醫(yī)生對(duì)患者的患病情況有進(jìn)一步了解，是目前診斷淋病感染的重要標(biāo)準(zhǔn)，也被稱作“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。隨著現(xiàn)在淋病的流行，對(duì)淋病奈瑟菌感染的診斷和治療變得更加困難。目前對(duì)該疾病已經(jīng)采用高敏性、特異性、具有較強(qiáng)操作性的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行診斷[3]，并初步取得了效果。現(xiàn)就檢驗(yàn)技術(shù)在淋病奈瑟菌中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行介紹。

1 淋病奈瑟菌的病原學(xué)檢驗(yàn)

1.1 淋病奈瑟菌的培養(yǎng)和鑒定介紹。分離培養(yǎng)基也分成GC-Lect培養(yǎng)基以及Thayer-Martin培養(yǎng)基，下面進(jìn)行詳細(xì)介紹。

（1）GC-Lect培養(yǎng)基：GC-Lect培養(yǎng)基是對(duì)Thayer-Martin培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)，并有效提高其選擇性以及分離靈敏度。根據(jù)相關(guān)檢測(cè)結(jié)果顯示：GC-Lect培養(yǎng)基上非目的菌生長(zhǎng)率不到10%，其主要組成部分包括：牛血紅蛋白、林可霉素、萬(wàn)古霉素等。這些成分有效提高了淋病奈瑟菌的臨床分離率，因此值得在臨床上推廣應(yīng)用[4]。

（2）Thayer-Martin培養(yǎng)基：由于淋病奈瑟菌的培養(yǎng)要求較高，在一般的血瓊脂上不宜生長(zhǎng)，因此可以在培養(yǎng)基上加上血紅蛋白，提高培育成功率。然而，該培養(yǎng)基方法不能有效抑制表皮葡萄球菌以及一些腸桿菌，因此培養(yǎng)的效果要遜色于GC-Lect培養(yǎng)基。

1.2 淋病奈瑟菌的分離培養(yǎng)方法。在臨床采樣之后，將標(biāo)本及時(shí)在專用的培養(yǎng)基上接種，并放置在4%-5%左右的CO2潮濕環(huán)境下培養(yǎng)48h左右，培養(yǎng)溫度為35℃[5]。值得注意的是，細(xì)菌培養(yǎng)的特異性較高，是目前診斷淋病最有效的方法之一，且適用于各種臨床標(biāo)本。然而，由于淋病奈瑟菌在機(jī)體外的抵抗力較弱，且對(duì)化學(xué)消毒劑非常敏感，因此在進(jìn)行標(biāo)本采集、運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程很容易影響到檢驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)相關(guān)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，可以在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)钠咸烟?，增加培養(yǎng)基的豐富程度，讓淋病奈瑟菌更加容易生長(zhǎng)[6]。

1.3 快速鑒定。

1.3.1 微量生化反應(yīng)板法：由于淋病奈瑟菌的培養(yǎng)較為困難，且常規(guī)的生化檢驗(yàn)不容易進(jìn)行。因此，研究人員利用Superoxol中的H2O2，對(duì)淋病奈瑟菌中的過(guò)氧化物歧化酶進(jìn)行檢測(cè)，并應(yīng)用微量生化反應(yīng)板對(duì)淋病奈瑟菌中的血清型菌株進(jìn)行研究。根據(jù)研究的結(jié)果表明，淋病奈瑟菌在使用微量生化反應(yīng)板檢測(cè)時(shí)具有方便、快捷等方面的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)檢測(cè)口腔和直腸位置的淋病具有臨床意義[7]。

1.3.2 熒光斑點(diǎn)法：由于產(chǎn)青霉素酶淋病奈瑟菌對(duì)青霉素等抗生素具有一定的耐藥性，且主要由粒質(zhì)構(gòu)成，因此可以使用熒光斑點(diǎn)法進(jìn)行檢測(cè)。熒光顯色劑的主要成本包括：含有11%甲醛的酒石酸鈉緩沖液，其pH值為4.5，并使用藻酸鈣拭子采集分泌物，并進(jìn)行檢測(cè)。然而根據(jù)相關(guān)調(diào)查顯示：該檢測(cè)方法對(duì)女性病人的診斷并不可靠，另外，在檢測(cè)的過(guò)程中需要使用紫外光分析儀，這也一定程度上限制了該方法的使用。

2 淋病奈瑟菌的分子生物學(xué)檢測(cè)方法

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)與細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)淋病奈瑟菌的比較研究。根據(jù)相關(guān)調(diào)查顯示，細(xì)菌培養(yǎng)與聚合酶鏈反應(yīng)在檢測(cè)淋病奈瑟菌方面具有一致性[8]。曾有研究使用聚合酶鏈反應(yīng)與細(xì)菌培養(yǎng)分別對(duì)100例感染者進(jìn)行檢測(cè)，而檢測(cè)結(jié)果顯示：兩種方法都能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出患者出現(xiàn)感染。此外，根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，引物設(shè)計(jì)使用opa作為靶基因，能夠有效提高淋病奈瑟菌檢測(cè)的敏感性[9]，研究人員也可以選擇一些耐藥性相關(guān)的引物進(jìn)行研究，并應(yīng)用在PCR技術(shù)上，以增加淋病奈瑟菌的耐藥性。

2.2 連接酶鏈反應(yīng)對(duì)淋病奈瑟菌的檢測(cè)方法。除了上述PCR檢測(cè)方法之外，還具有一種名為連接酶鏈反應(yīng)的快速DNA擴(kuò)增方法[10]。與PCR方法不相同的是，該方法主要采用兩對(duì)寡核苷酸探針進(jìn)行檢查，每一對(duì)寡核苷酸探針處于相鄰位置，兩者之間形成缺口[11]。其檢測(cè)原理包括：通過(guò)變性與連接循環(huán)，靶DNA鏈片段呈指數(shù)擴(kuò)增。根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，連接酶鏈反應(yīng)的特異性要比PCR高。

某試驗(yàn)對(duì)23例患上淋病的女性進(jìn)行尿液樣本連接酶鏈反應(yīng)檢測(cè)，23例女性患者均經(jīng)過(guò)連接酶鏈反應(yīng)檢測(cè)出陽(yáng)性，有18例患者培養(yǎng)基檢測(cè)出陽(yáng)性。并對(duì)檢測(cè)結(jié)果不一樣的標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測(cè)，均顯示為陽(yáng)性[12]。有檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，連接酶鏈反應(yīng)檢測(cè)與拭子培養(yǎng)的敏感性分別為100%與78.26%。連接酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法方便快捷，并具有較高的敏感性和特異性[13]，因此可以使用于女性患者或大規(guī)模的STD檢查。然而值得注意的是，在檢查的過(guò)程中，依然要避免污染，否則會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果。

2.3 自身淬滅探針熒光定量PCR檢測(cè)法。以粒質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品，可以設(shè)計(jì)出相關(guān)的技術(shù)來(lái)對(duì)淋病奈瑟菌進(jìn)行檢測(cè)，其中常見(jiàn)的是身淬滅探針熒光定量PCR檢測(cè)法[14]。根據(jù)相關(guān)的研究表明，對(duì)自身淬滅當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為105ul時(shí)，使用該方法檢測(cè)的線性關(guān)系較為良好。根據(jù)相關(guān)的結(jié)果顯示，該檢測(cè)方法主要適用于臨床對(duì)分離的淋病奈瑟菌進(jìn)行檢測(cè)，其特異性和敏感性都較高。

2.4 膜基因芯片技術(shù)檢測(cè)法。淋病奈瑟菌是性傳播疾病的重要病原體之一，感染時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)多種病原體混合的現(xiàn)象，且多種病原體會(huì)出現(xiàn)互相激活或促進(jìn)的作用[15]。因此，對(duì)淋病奈瑟菌所引起的性傳播疾病進(jìn)行檢測(cè)和治療是非常重要的。目前主要建立起膜基因芯片技術(shù)檢測(cè)法，該檢測(cè)方法能夠有效對(duì)淋病奈瑟菌、沙眼衣原體等病原體進(jìn)行有效的檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)的結(jié)果表明：膜基因芯片在檢測(cè)的過(guò)程中無(wú)放射性污染，其敏感度較高，其中尼龍膜可以有效將增強(qiáng)單鏈和雙鏈的DNA能力增強(qiáng)，并能進(jìn)行循環(huán)再用。此外，該技術(shù)還能夠?qū)o(wú)癥狀的人群進(jìn)行篩選檢驗(yàn)，檢驗(yàn)具有迅速的特點(diǎn)。

2.5 單管多重PCR技術(shù)檢測(cè)法。由于性傳播疾病有多種病原體混合，從而產(chǎn)生感染，根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，以單管多重PCR技術(shù)對(duì)多種感染源進(jìn)行檢測(cè)，如對(duì)淋病奈瑟菌、人型支原體、沙眼衣原體等病原體進(jìn)行DNA檢測(cè)，具有良好的檢查的檢測(cè)效果。該研究主要對(duì)200例疑似性傳播疾病感染者進(jìn)行檢驗(yàn)，均使用單管多重PCR技術(shù)檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果顯示，采用該技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)與使用“金標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行確診的結(jié)果相一致，這表明了檢測(cè)技術(shù)的敏感性和特異性較高。

此外，該檢查方法具有方便、快捷等方面的優(yōu)勢(shì)，因此該技術(shù)也與上述膜基因芯片技術(shù)檢測(cè)法并列成為病原生物學(xué)基因診斷的重要診斷技術(shù)。

3 淋病奈瑟菌的免疫學(xué)檢測(cè)分析

3.1 協(xié)同凝集試驗(yàn)法。SPA（葡萄球菌A蛋白）具有與人體IgG Fc斷相結(jié)合的功能，且不會(huì)影響Fc斷的活性。因此，可以利用SPA對(duì)淋病奈瑟菌進(jìn)行檢測(cè)，具有方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法。該方法主要使用單克隆抗體固相酶對(duì)男性急性淋病奈瑟菌感染者進(jìn)行檢測(cè)，并具有較為準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。然而該方法并不適用于女性以及感染部位為直腸或口腔的淋病患者。

3.3 斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)法。相關(guān)研究人員在研究過(guò)程中成功研制出抗淋球菌，并建立了斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)法以及生物素-鏈霉親和素對(duì)淋病奈瑟菌進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。根據(jù)檢查的結(jié)果顯示：斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)法以及生物素-鏈霉親和素能有效檢測(cè)出淋病奈瑟菌的敏感性和特異性，分別為：96.52%、92.48%和96.27%、89.28%。根據(jù)數(shù)據(jù)表明，該檢驗(yàn)方法能適用于淋病奈瑟菌的免疫檢驗(yàn)，能夠檢測(cè)出淋病奈瑟菌的敏感性和特異性，并具有較高的準(zhǔn)確性。

4 淋病奈瑟菌耐藥性檢測(cè)分析

淋病奈瑟菌的檢測(cè)，對(duì)淋病的預(yù)防和控制、治療等方面都具有重要作用。臨床上將淋病奈瑟菌主要分為血清學(xué)分型、營(yíng)養(yǎng)分型以及基因分型三種[16]。關(guān)于分型的方法，傳統(tǒng)分型主要是根據(jù)淋病奈瑟菌菌毛的情況進(jìn)行分型。而隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，其分型技術(shù)的應(yīng)用也較多，主要包括：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分型、OPA分型、PFGE分型等，這些分型法對(duì)產(chǎn)青霉素酶淋病奈瑟菌等具有耐藥性菌株的分離鑒定有著重要的作用。

某研究將使用測(cè)定的200株NG，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)粒譜型分析，研究結(jié)果顯示，NG具有抗生素耐藥的特性，對(duì)其使用頭孢曲松進(jìn)行治療的作用非常大。然而按照國(guó)際疾病預(yù)防提示，當(dāng)其病原體對(duì)某抗生素的耐藥率>5%時(shí)，該抗生素的療效便大大降低，因此不建議以此作為首選藥物。

5 結(jié)束語(yǔ)

目前國(guó)內(nèi)淋病奈瑟菌的檢驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)不斷發(fā)展，從而大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。盡管我國(guó)臨床上對(duì)該技術(shù)的處理依然存在著各種不足，但隨著科技的不斷進(jìn)步，實(shí)驗(yàn)條件不斷改善以及試驗(yàn)的相關(guān)流程和規(guī)范建立起來(lái)，對(duì)淋病奈瑟菌感染的檢測(cè)和診斷也會(huì)不斷進(jìn)步，診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性也會(huì)不斷提升，并能廣泛應(yīng)用到淋病奈瑟菌感染以及其它性傳播疾病的檢驗(yàn)診斷當(dāng)中，并具有較為廣闊的研究前景。

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第5篇：微生物方法學(xué)研究范文

【摘要】 目的：利用尿素酶試驗(yàn)的方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)。方法：采用液體結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)基加尿素和酚紅指示劑，高壓消毒滅菌，將分離純培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌接種其中， 再加入不同濃度的抗結(jié)核分枝桿菌的藥物培養(yǎng)，分別設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。待陰、陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果完全清晰時(shí)，終止培養(yǎng)，觀測(cè)結(jié)果。結(jié)果：結(jié)核分枝桿菌、在500 cfu/mL以上時(shí)，結(jié)果在3 d～7 d內(nèi)顯現(xiàn);在500條以內(nèi)時(shí)，其結(jié)果在培養(yǎng)7 d～10 d內(nèi)顯現(xiàn)；陽(yáng)性菌株中，通過(guò)加溫處死，其尿素酶試驗(yàn)均為陰性；與傳統(tǒng)的絕對(duì)濃度法比較，差異無(wú)顯著性（χ2=2.25，P＞0.10）。結(jié)論：尿素酶試驗(yàn)方法快速、簡(jiǎn)便，將對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)提供一種新方法。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)核分支桿菌；尿素酶；耐藥性

Abstract Objective:To determinate drug resistance of tubercle bacillus by employing urease test．Methods: The observed purified mycobacterium were inoculated into the specific autoclaved fluid mycobacterium medium with urea and Phenol Red， and incubated with different concentration of anti-tubercle bacillus drugs until the corresponding negative and positive results became apparent．Results: The results became apparent at 3 to 7 days when mount of the incubated mycobacterium is more than 500 cfu/mL， and 7 to 10 days when mount is less than 500 cfu/ml. To avoid the fake positive samples， the positive mycobacteriums were heating-killed and all tested as negative by urease test．Compared with traditional absolute concentration method， urease test method had no statistic differences (χ2=2.25，P＞0.05)。Conclusion: Urease　testing is a convenient and rapid method to inspect drug resistance of mycobacterium tuberculosis.

Key words Mycobacterium tuberculosis；Urease；Drug resistance

尿素酶是一種胞外酶，多數(shù)細(xì)菌含有該酶，可分解尿素，使環(huán)境變堿，所以，常用尿素酶試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行細(xì)菌的鑒定。分枝桿菌多數(shù)菌種含有尿素酶，如結(jié)核分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、胃分枝桿菌均為陽(yáng)性。而這些分枝桿菌是臨床結(jié)核病的主要病原體。

尿素酶的存在是結(jié)核菌具有活性的標(biāo)志之一，如果在培養(yǎng)中加入某種藥，控制了該酶的產(chǎn)生，則說(shuō)明某種藥物對(duì)結(jié)核分枝桿菌有殺菌效果。否則尿素酶繼續(xù)產(chǎn)生，利用該機(jī)制我們?cè)O(shè)計(jì)了結(jié)核分枝桿菌耐藥性的尿素酶測(cè)定試驗(yàn)?，F(xiàn)將我們的研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：本室保存的耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株，臨床標(biāo)本常規(guī)處理后，分離培養(yǎng)鑒定結(jié)核分枝桿菌菌株。對(duì)照菌株購(gòu)自中國(guó)生物藥物鑒定所細(xì)菌室（菌株編號(hào)H37RV）。

1.1.2 培養(yǎng)基：絕對(duì)濃度法采用豆浸液改良羅氏培養(yǎng)基［1］；尿素酶法采用含尿素和酚紅指示劑的結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)基（蘇通氏培養(yǎng)基）。

1.1.3 抗癆藥物：14種抗癆藥物均購(gòu)自上海醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司信宜制藥總廠，其中利福平(RFP)、 異煙肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、 利福定 (RFD)、利福噴丁(RFPD)、吡嗪酰胺（PAZ）、立刻肺疾、卷曲霉素(CPM)、環(huán)絲氨酸(CS)取得該廠的純品藥物；而卡那霉素(KM) 、對(duì)氨柳酸（PAS）、丁胺卡那、奧復(fù)星、鏈霉素(SM) 使用該廠的注射用瓶裝藥，取得了該廠此批藥物的藥物效價(jià)，并嚴(yán)格按照結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程中，抗結(jié)核藥物溶液配制及稀釋的方法進(jìn)行計(jì)量的折算［1］。

1.2 方法

1.2.1 含尿素結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基的制備：成分：天門(mén)冬酸4.0 g，枸櫞酸2.0 g， k2HpO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，0.1%酚紅25 mL，枸櫞酸鐵銨0.05 g，甘油 60 mL，蒸餾水1 000 mL，尿素 12 g(0.12%)［1］，另外采用固體方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)時(shí)，培養(yǎng)基可選擇改良羅氏培養(yǎng)基。其制備方法略有不同。

制備方法：將上述成分混合于蒸餾水中，加溫溶解，調(diào)pH為6.8，過(guò)濾，分裝三角燒瓶，每瓶裝99 mL，121.3 ℃15 min，高壓滅菌，4 ℃～8 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 瓊脂絕對(duì)濃度法培養(yǎng)基的制備與藥物的濃度：絕對(duì)濃度法嚴(yán)格根按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)，結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程的方法操作［1］。

1.2.3 試驗(yàn)菌液的配制：將試驗(yàn)菌接種于豆浸液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d，待生長(zhǎng)至培養(yǎng)基斜面的1/3以上時(shí)，刮取菌落，粘磨，并用硫酸鋇比濁管比濁，用Teen-80生理鹽水配成5×105/mL～5×106/mL菌懸液，采用10倍遞次稀釋，待用。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)的操作方法：將分離培養(yǎng)、鑒定，并稀釋配置成5×103 cfu/mL的濃度的結(jié)核分枝桿菌，分別接種在已分裝好的，含有藥物的14管培養(yǎng)基中，每管接種0.2 mL，使每管培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃度約為500 cfu/mL，每種藥物分別作高低兩種濃度的試驗(yàn)，設(shè)空白對(duì)照各1管， 尿素酶陽(yáng)性菌株對(duì)照1管，37 ℃培養(yǎng)7 d～10 d， 以陽(yáng)性菌株的培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色，為終止培養(yǎng)的判定終點(diǎn)。同時(shí)用傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌耐藥測(cè)定法-絕對(duì)濃度法，進(jìn)行接種作為對(duì)照，觀測(cè)其該方法（尿素酶法）與傳統(tǒng)法在耐藥性檢測(cè)中的相符性或有無(wú)顯著的差異。

1.2.5 結(jié)果判斷：培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色為耐藥，培養(yǎng)基呈現(xiàn)黃色為敏感，培養(yǎng)基呈現(xiàn)淡紅色為中度敏感（或中度耐藥）。

1.2.6 質(zhì)控方式：每次均用結(jié)核分枝桿菌H37RV藥物敏感株作對(duì)照，進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2.7 數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)：采用配對(duì)資料的卡方檢驗(yàn)以及符合率的計(jì)算。

2 結(jié)果

兩種方法檢測(cè)臨床鑒定結(jié)核分枝桿菌耐藥性的結(jié)果分析，見(jiàn)表1～表4。表1 兩種方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)14種抗癆藥物耐藥結(jié)果從表1的結(jié)果分析，尿素酶法檢出耐藥菌株173株，總耐藥率24.3%；傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法檢出耐藥菌株180株，總耐藥率25.7%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，尿素酶檢測(cè)法與傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法，在對(duì)上述結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè)中，差別無(wú)顯著性（χ2=2.25，P＞0.10）。說(shuō)明尿素酶法在對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè)方面具有可靠性，其檢出結(jié)果與傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法具有可比性，兩種方法無(wú)顯著性差異。表2 兩種方法檢測(cè)167株結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福定耐藥性結(jié)果的比較表2的結(jié)果分析若以傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法檢測(cè)的結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，則尿素酶法檢測(cè)RFD耐藥性符合率為96.4%。 表3 尿素酶法檢測(cè)50株對(duì)吡嗪酰胺耐藥的結(jié)核分枝桿菌重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果比較

對(duì)臨床分離鑒定的并用絕對(duì)濃度法測(cè)定的50株耐吡嗪酰胺的結(jié)核分枝桿菌，用尿素酶進(jìn)行了耐吡嗪酰胺的重復(fù)性試驗(yàn)，首次檢測(cè)耐藥菌株數(shù)48株，敏感2株；再次檢測(cè)，敏感菌株為1株，耐藥菌株49株，符合率94%（47/50）。

武延雋等.利用尿素酶試驗(yàn)測(cè)定結(jié)核分支桿菌耐藥性的方法學(xué)研究表4 兩種方法檢測(cè)5種規(guī)定必作藥敏結(jié)果

藥物尿素酶法測(cè)定結(jié)果傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法測(cè)定結(jié)果敏感株耐藥株符合率(%)異煙肼（n=50）敏感株350 耐藥株015100乙胺丁醇（n=50）敏感株450 耐藥株05100鏈霉素（n=50）敏感株52 耐藥株04396對(duì)氨柳酸（n=50）敏感株355 耐藥株01090利福平（n=50）敏感株350 耐藥株51090

用兩種方法檢測(cè)50株臨床分離鑒定的結(jié)核分支桿菌對(duì)5種必作藥物的耐藥性，結(jié)果見(jiàn)表4。檢測(cè)異煙肼藥敏結(jié)果相符50株（100%）。不符0株（0%）；檢測(cè)乙胺丁醇藥敏結(jié)果相符50株（100%），不符0株（0%）；檢測(cè)鏈霉素藥敏結(jié)果相符48株（96%），不符2株（4%）；檢測(cè)對(duì)氨柳酸藥敏結(jié)果相符45株（90%），不符5株（10%）；檢測(cè)利福平藥敏結(jié)果相符45株（90%），不符5株（10%）。

3 討論

尿素酶試驗(yàn)是鑒定性試驗(yàn)，應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的耐藥性檢測(cè)，主要是通過(guò)恢復(fù)性試驗(yàn)，觀測(cè)尿素酶檢測(cè)結(jié)果的敏感試驗(yàn)管和耐藥試驗(yàn)管中細(xì)菌的存活情況，本文結(jié)果顯示，在耐藥試驗(yàn)管中的結(jié)核分枝桿菌，在無(wú)藥的豆浸液羅氏培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而敏感試驗(yàn)管中的結(jié)核分枝桿菌在該培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)。特異試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，處死菌尿素酶試驗(yàn)均為陰性，而未處死菌均為陽(yáng)性，表明通過(guò)尿素酶方法所檢出的藥敏試驗(yàn)的特異性。

在對(duì)結(jié)核分支桿菌的耐藥性檢測(cè)中，用兩種方法檢測(cè)異煙肼、乙胺丁醇相符率為100%；檢測(cè)鏈霉素相符率為96%；檢測(cè)PAS和利福平相符率90%。尿素酶檢測(cè)法與傳統(tǒng)絕對(duì)濃度法差別無(wú)顯著性（χ2=2.25，P＞0.10）；說(shuō)明尿素酶法與傳統(tǒng)的絕對(duì)濃度法檢出的結(jié)果具有可比性。然而，尿素酶法是利用細(xì)菌生理狀態(tài)的改變，來(lái)確定細(xì)菌對(duì)某種藥物的敏感性的，這種方法比絕對(duì)濃度法時(shí)間短，絕對(duì)濃度法的結(jié)果需要30 d的時(shí)間，而尿素酶法最長(zhǎng)時(shí)間10 d；尿素酶法在培養(yǎng)基的制備，具體的操作上都比較容易，有利于臨床推廣使用。

應(yīng)當(dāng)指出的是：因有些分枝桿菌的尿素酶均為陰性，如戈氏分枝桿菌，蟾蜍分支桿菌，鳥(niǎo)分枝桿菌以及胞內(nèi)分枝桿菌，尿素酶方法不能用于這些分枝桿菌株的耐藥性的檢測(cè)；該方法的靈敏度與噬菌體生物裂解法有一定的近似性，在500 cfu/mL時(shí)以上時(shí)，結(jié)果在3 d內(nèi)顯現(xiàn);在500 cfu/mL內(nèi)時(shí)，其結(jié)果在培養(yǎng)7 d～10 d內(nèi)顯現(xiàn)，所以當(dāng)標(biāo)本中菌數(shù)較少時(shí)一般不要做直接的尿素酶法的耐藥性測(cè)定，直接對(duì)標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行耐藥性測(cè)定的條件有待進(jìn)一步研究；該試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基的pH值對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果有一定的影響，所以用弱酸弱堿處理過(guò)的試驗(yàn)菌一定要進(jìn)行pH值的調(diào)整，應(yīng)將pH值調(diào)整至6.8，否則影響試驗(yàn)結(jié)果。在試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基中不可用天門(mén)冬素（L-天門(mén)冬酰胺），有該藥的培養(yǎng)基經(jīng)高壓消毒滅菌后L-天門(mén)冬酰胺可破壞產(chǎn)生胺可使培養(yǎng)基的pH值改變，顯示紅色。

總之，盡管有多種因素可影響該試驗(yàn)的結(jié)果，但因本方法操作簡(jiǎn)便，省時(shí)，有一定的特異性和敏感性，所以將對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)提供一種新方法。

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第6篇：微生物方法學(xué)研究范文

【關(guān)鍵詞】 廣藿香油；藿香油；綜述

廣藿香油又稱百秋李油，是從唇形科刺蕊草屬植物廣藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.中提取的揮發(fā)油，是廣藿香的主要藥用成分。藿香油是從唇形科藿香屬植物(土)藿香Agastache rugosa (Fisch.et Meyer)O.ktze中提取的揮發(fā)油，是常見(jiàn)的天然香料。兩者來(lái)源不同，但目前在應(yīng)用上有人不加以區(qū)分。這一做法是否合理？?jī)烧呤欠窨梢曰煊?？為此，筆者將從歷史沿革、成分研究、藥理研究和安全性研究進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，以期為廣藿香油及藿香油的合理運(yùn)用提供依據(jù)。

1 歷史沿革

目前，廣藿香油與藿香油出現(xiàn)混用的狀況與歷史上廣藿香與(土)藿香的混用有很大關(guān)系，因此，有必要弄清楚中藥材發(fā)展史上廣藿香與藿香的關(guān)系。中醫(yī)處方中的藿香，均以藿香名之，更未明確規(guī)定其品種[1-2]。一般認(rèn)為，廣藿香和(土)藿香是中藥材藿香的2個(gè)不同品種。自宋金元以來(lái)，本草著作中記載的藿香均為廣藿香，而明代以來(lái)一些本草著作中記載的藿香則為(土)藿香[3]。有學(xué)者則認(rèn)為廣藿香與(土)藿香混用是因?yàn)榈胤接盟幜?xí)慣不同而混淆藥名[4]。目前，廣藿香多以其揮發(fā)油或全草配合其他中草藥組成復(fù)方使用。從歷年版《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱“《藥典》”)收載情況來(lái)看，只有1977版《藥典》同時(shí)收載(土)藿香和廣藿香[5]，以后各版《藥典》均只收載廣藿香，而2005版《藥典》更是將廣藿香油列入植物油脂和提取物項(xiàng)下單獨(dú)收載[6]。由此可見(jiàn)，廣藿香才是藥用藿香的正品。實(shí)際上，藿香在我國(guó)歷史上最初并非作為藥物，而是作為香料為人們所應(yīng)用[3]。直至現(xiàn)代，廣藿香油和藿香油作為天然香料亦受到國(guó)內(nèi)外香精香料研究工作者的重視。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)廣藿香油和藿香油，必須對(duì)兩者加以深入研究。

2 成分研究

2.1 廣藿香油

對(duì)廣藿香油成分的研究分析開(kāi)展較早，且隨著氣相色譜(GC)、氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)的普及，揮發(fā)油的分析越發(fā)簡(jiǎn)便。張氏等[7]運(yùn)用GC-MS法從廣藿香揮發(fā)油中分出了55個(gè)成分，鑒定了其中24個(gè)，其中廣藿香醇含量達(dá)31.86%。王氏等[8]運(yùn)用GC-MS從高產(chǎn)廣藿香揮發(fā)油中分出64個(gè)化學(xué)成分，并鑒定了其中31個(gè)，其中廣藿香醇含量為31.66%，廣藿香酮含量為23.58%。

隨著研究的不斷深入，研究者們分別對(duì)不同產(chǎn)地、不同采收期的廣藿香揮發(fā)油進(jìn)行了研究。羅氏等[9]運(yùn)用GC-MS聯(lián)用技術(shù)比較了不同產(chǎn)地、不同采收期的廣藿香揮發(fā)油的主要成分含量，并根據(jù)揮發(fā)油成分的不同，將不同產(chǎn)地的廣藿香分為2個(gè)化學(xué)型，即廣藿香酮型和廣藿香醇型。在廣藿香揮發(fā)油質(zhì)量控制方面也有相關(guān)報(bào)道，魏氏等[10]通過(guò)GC-MS法對(duì)不同采集期石牌廣藿香及其他產(chǎn)地的廣藿香揮發(fā)油進(jìn)行比較分析，建立了石牌廣藿香揮發(fā)油的指紋圖譜。

以上文獻(xiàn)及大量相關(guān)的研究表明，廣藿香油的主要成分有2個(gè)，分別是廣藿香醇(Pachouli alcohol)和廣藿香酮(Pogostone)。兩者在廣藿香揮發(fā)油中的相對(duì)含量按品種和產(chǎn)地不同有一定的差異。其結(jié)構(gòu)式如下：

2.2 藿香油

目前國(guó)內(nèi)對(duì)藿香油的研究較少，而國(guó)外對(duì)藿香屬植物的揮發(fā)油成分研究較多。Fujita等[11]對(duì)日本境內(nèi)的藿香進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在大阪、兵庫(kù)縣附近生長(zhǎng)的藿香A.rugosa var.hypoleuca Kudo的揮發(fā)油成分主要為甲基胡椒酚(Estragole，占總量的90%)，在北海道采集的藿香A.rugosa var. methyleugenolifera Fujita揮發(fā)油的主要成分則為丁香酚甲醚(占總量的80%以上)。王氏等[12]采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，分別對(duì)采自湖北巴東縣、河南鄭州郊區(qū)與河南欒川縣的藿香A.rugosa揮發(fā)油進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自巴東及鄭州的藿香揮發(fā)油主要成分均為甲基胡椒酚，而產(chǎn)自欒川的藿香揮發(fā)油主要成分則為丁香酚甲醚。通過(guò)研讀國(guó)內(nèi)外關(guān)于藿香揮發(fā)油研究的文獻(xiàn)，可以認(rèn)為，絕大多數(shù)藿香揮發(fā)油的主要成分均為甲基胡椒酚。其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖3。

3 藥理研究

3.1 廣藿香油

國(guó)內(nèi)對(duì)廣藿香油的藥理研究較為廣泛，趙氏等[13]研究了廣藿香油對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響和對(duì)醋酸引起扭體實(shí)驗(yàn)的影響，研究了廣藿香油的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。有學(xué)者研究認(rèn)為，藿膽丸中廣藿香油具有抗炎、抗過(guò)敏的作用[14-15]。蘇氏等[16]對(duì)11種真菌和5種細(xì)菌進(jìn)行了體外抗菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，廣藿香油對(duì)黃曲霉和黑曲霉的抑制能力較差，但對(duì)新型隱球菌、球毛殼霉和短柄帚霉的生長(zhǎng)抑制比較顯著，其最低抑菌濃度(MIC)低于0.11 mL/L，預(yù)示其具有治療艾滋病患者(AIDS)并發(fā)隱球菌感染及新型隱球菌引起的肺炎、慢性腦膜炎的前景；對(duì)能感染身體任何部位的白色念珠菌的抑制能力也比較好(MIC為0.14 mL/L)；而對(duì)小孢子菌的抑制有助于治療表皮癬菌病。

在抗細(xì)菌實(shí)驗(yàn)中，除大腸桿菌外對(duì)4種細(xì)菌都較為敏感，表明廣藿香油具有較強(qiáng)的抗菌活性。劉氏等[17]對(duì)以廣藿香油為主要成分的藿香正氣水進(jìn)行的藥理研究表明，廣藿香油對(duì)豚鼠離體十二指腸自動(dòng)收縮及對(duì)組胺、乙酰膽堿(Ach)、氯化鋇所致的回腸收縮均有良好的抑制作用，也能對(duì)抗垂體后葉素引起的子宮平滑肌收縮。國(guó)外對(duì)廣藿香油的研究也散見(jiàn)于相關(guān)文獻(xiàn)。Osawa等[18]報(bào)道，廣藿香油可抑制放線桿菌屬、梭桿菌屬、噬二氧化碳細(xì)胞菌屬、?？暇寮邦悧U菌屬等多種牙周病菌。Pattnaik S等[19]發(fā)現(xiàn)，廣藿香油對(duì)20種細(xì)菌和12種真菌具有抑制作用。Wei A等[20]報(bào)道廣藿香油中的百秋李醇具有顯著的抗氧化活性。Yang Y等[21]研究發(fā)現(xiàn)廣藿香油具有止吐作用。

3.2 藿香油

國(guó)內(nèi)比較少見(jiàn)對(duì)藿香油的單獨(dú)研究。Shin S等[22]對(duì)藿香油及其中的主要成分Estragole進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)藿香油及甲基胡椒酚都對(duì)真菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用；另一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)，甲基胡椒酚對(duì)念珠菌有抑制作用。Friedman M等[23]在一項(xiàng)抗菌物質(zhì)篩選實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，甲基胡椒酚對(duì)空腸彎曲桿菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增多性李司忒(氏)菌和沙門(mén)氏菌都表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

3.3 廣藿香油與藿香油抗菌作用比較

楊氏等[24-25]通過(guò)研究廣藿香油與藿香油對(duì)16種皮膚細(xì)菌的體外抑制作用發(fā)現(xiàn)，藿香油抗菌作用很弱，干燥棒桿菌、固著微球菌和莫拉氏菌3種最敏感的菌種在油濃度高達(dá)1500 μL/L時(shí)仍表現(xiàn)出與對(duì)照組細(xì)菌幾乎相同的生長(zhǎng)速度和菌落特征；而廣藿香油在藥物培養(yǎng)基小于400 μL/L時(shí)仍可完全抑制16種供試菌當(dāng)中的13種。結(jié)果更顯示，廣藿香揮發(fā)油在某種濃度下能抑制異源或負(fù)責(zé)菌的生長(zhǎng)繁殖，而不破壞正常微生物的生態(tài)平衡。在另一項(xiàng)研究廣藿香油與藿香油對(duì)12種皮膚癬菌和條件致病真菌的體外抑制作用中，發(fā)現(xiàn)2種油都可以選擇性地完全抑制皮膚癬菌的生長(zhǎng)繁殖，而對(duì)條件致病菌的生長(zhǎng)繁殖幾乎沒(méi)有影響，其中廣藿香油表現(xiàn)出對(duì)皮膚癬菌很好的特異選擇性抑制作用(MIC為50～400 μL/L)。而藿香油對(duì)皮膚癬菌抑制作用較弱(MIC為700～1000 μL/L)。

4 安全性研究

4.1 廣藿香油安全性研究

迄今尚未發(fā)現(xiàn)廣藿香油或其主要成分廣藿香酮及廣藿香醇的相關(guān)安全性研究報(bào)道。2005版《藥典》并未明確規(guī)定其用量，只是要求按具體處方量添加[7]。在常用的藿香正氣制劑中，包括藿香正氣口服液、藿香正氣水、藿香正氣軟膠囊，在2005版《藥典》中均以廣藿香油替代[26]。

4.2 藿香油安全性研究

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于藿香油安全性研究的報(bào)道多為翻譯或參考國(guó)外資料。國(guó)外報(bào)道較多的主要為藿香油中主要成分Estragole的安全性數(shù)據(jù)。在致癌性研究中顯示，長(zhǎng)期飼服甲基胡椒酚或皮下注射、腹腔內(nèi)注射甲基胡椒酚均證實(shí)其具有致癌性，且多為肝臟腫瘤；研究還發(fā)現(xiàn)，甲基胡椒酚的1-羥基代謝物具有更強(qiáng)的致肝癌性[27-28]。在致突變性研究中顯示，Ames試驗(yàn)中對(duì)大多數(shù)菌株均有致突變性[29-30]。其他研究發(fā)現(xiàn)，甲基胡椒酚的代謝產(chǎn)物(1-羥基甲基胡椒酚等)可在體內(nèi)及體外形成肝臟DNA加合物[31-32]。在藥物動(dòng)力學(xué)及藥物代謝學(xué)研究中則發(fā)現(xiàn)，甲基胡椒酚的代謝途徑有2種：一種是以CO2為最終代謝產(chǎn)物排泄；另一種是以1-羥基甲基胡椒酚為最終代謝產(chǎn)物排泄[33-34]。兩種代謝途徑同時(shí)存在，并與給藥劑量有關(guān)。

5 小結(jié)

上述研究表明，廣藿香油與藿香油來(lái)源于同科不同屬植物的提取物，化學(xué)成分和藥理作用明顯不一樣。廣藿香油主要含廣藿香醇及廣藿香酮(總量占40%以上)，不含甲基胡椒酚，具有抗炎、抗過(guò)敏、提高免疫、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗痙攣、抗氧化、止吐等作用，且無(wú)不良反應(yīng)報(bào)道，在中成藥中大量應(yīng)用；藿香油主要含甲基胡椒酚(占80%以上)，不含廣藿香醇及廣藿香酮，雖有抗菌作用，但遜于廣藿香油；具有抗菌、解痙、鎮(zhèn)靜及升高白細(xì)胞的作用，但存在致癌和致突變的安全性問(wèn)題，目前未見(jiàn)在藥品中應(yīng)用。特別值得關(guān)注的是，廣藿香和藿香在中藥處方中曾有混用的歷史，現(xiàn)在仍在混用；而廣藿香油及藿香油應(yīng)用范圍涵蓋了藥品、食品、香料等領(lǐng)域，在使用過(guò)程中必須對(duì)兩者的安全性加以考慮，區(qū)分運(yùn)用。目前，國(guó)內(nèi)常用廣藿香油替代廣藿香和藿香用于中成藥生產(chǎn)，而非用藿香油替代廣藿香和藿香，正是基于藥效和安全性的考慮。

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