健康兒童口腔微生物的定植研究

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[摘要]人體是一個(gè)由真核細(xì)胞和共生在體內(nèi)的微生物群落共同構(gòu)成的超級(jí)生物體?？谇唬鳛槲⑸镞M(jìn)入身體的門戶，其微生物群落的正常確立及平衡維持對(duì)口腔局部及全身系統(tǒng)的健康都有非常重要的作用。在母體內(nèi)，嬰兒就開(kāi)始不斷發(fā)生人與人或人與環(huán)境之間的緊密接觸，從而與微生物之間建立密切聯(lián)系。不同的生產(chǎn)方式，不同的喂養(yǎng)方式均能影響微生物在新生兒口腔中的定植。在乳牙列期，乳牙萌出為微生物的定植提供了新的生態(tài)位點(diǎn)，口腔微生物的構(gòu)成隨之發(fā)生變化。隨著恒牙的萌出，口腔環(huán)境進(jìn)一步變化，微生物的定植也發(fā)生變化直至成熟，即微生物定植種類更加豐富，牙周致病菌的定植也顯著增加。

[關(guān)鍵詞]口腔微生物；早期定植；年齡

現(xiàn)代生物學(xué)觀念認(rèn)為，人體是一個(gè)由真核細(xì)胞和共生在體內(nèi)的微生物群落共同構(gòu)成的超級(jí)生物體[1]。人體的代謝是由宿主自身基因組調(diào)節(jié)的各種代謝途徑以及微生物基因組調(diào)節(jié)的代謝過(guò)程共同組成，這種宿主與微生物之間的共同代謝過(guò)程最終調(diào)節(jié)著宿主的整體健康。人類個(gè)體的健康狀況與寄居微生物緊密相關(guān)。從出生后，嬰兒就開(kāi)始不斷發(fā)生人與人或人與環(huán)境之間的緊密接觸，從而與微生物之間建立密切聯(lián)系。在人體口腔中，微生物定植的第一步就是細(xì)菌的黏附。在嬰兒期的最初幾個(gè)月，口腔中能發(fā)生細(xì)菌黏附的只有黏膜表面，隨著牙的萌出，細(xì)菌黏附位點(diǎn)顯著增加。細(xì)菌的黏附不僅發(fā)生于細(xì)菌與口腔位點(diǎn)之間，也同樣發(fā)生于細(xì)菌相互之間。例如綠色鏈球菌，以及另一種嚴(yán)格厭氧菌-具核梭桿菌之間即可發(fā)生特異性黏附。從嬰兒期開(kāi)始，個(gè)體口腔微生物的定植已經(jīng)有明顯的不同，嬰兒的照顧者及其他親密接觸者的口腔微生物種類對(duì)嬰兒口腔微生物的定植有明顯影響[2]。同時(shí)，嬰兒的飲食或藥物的應(yīng)用等也對(duì)微生物在口腔的定植產(chǎn)生影響。在乳牙開(kāi)始萌出后，牙的出現(xiàn)為微生物的定植提供了新的生態(tài)位點(diǎn)，口腔微生物的構(gòu)成有明顯改變。在混合牙列期，恒牙開(kāi)始萌出，口腔微生物構(gòu)成也發(fā)生新的變化。目前隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更多的非培養(yǎng)，高通量方式被應(yīng)用于口腔微生物的檢測(cè)中，如DNA芯片，高通量測(cè)序等。這些方式的應(yīng)用讓研究者對(duì)人類口腔微生物的定植產(chǎn)生了新的理解。在這個(gè)新的技術(shù)時(shí)期之前，研究者們推測(cè)口腔內(nèi)存在的細(xì)菌約有1000余個(gè)種屬或者種系型[3]，但目前的研究發(fā)現(xiàn)口腔內(nèi)的微生物種屬可能高達(dá)19000個(gè)[4]，其中絕大多數(shù)為不能培養(yǎng)的細(xì)菌。同時(shí)，目前的研究也發(fā)現(xiàn)口腔的感染性疾病，如牙周疾病或是齲病，并非單一菌種感染致病，而是多菌種協(xié)同致病的結(jié)果[5-6]。口腔微生物在口腔內(nèi)各個(gè)生態(tài)位點(diǎn)定植，相互作用，其整體的平衡與失衡與口腔及全身健康息息相關(guān)。那么，了解口腔微生物在健康狀況下的定植，并進(jìn)一步對(duì)比其在疾病狀況下的變化，對(duì)進(jìn)一步了解對(duì)口腔這一微生物進(jìn)入身體的門戶至關(guān)重要。本文主要對(duì)近年來(lái)年齡相關(guān)的口腔微生物正常定植情況研究進(jìn)行綜述。

1胎兒期

過(guò)去，人們一直認(rèn)為，胎兒在子宮內(nèi)是在無(wú)菌環(huán)境下發(fā)育完成的。但是，Bearfield等[7]發(fā)現(xiàn)，70%孕婦的羊水中出現(xiàn)了口腔微生物的早期定植。其中最常見(jiàn)的微生物為具核梭桿菌，一種牙周可疑致病菌。這也有力解釋了為什么孕婦及低體重兒具有高牙周疾病感染風(fēng)險(xiǎn)。在懷孕期間，口腔微生物可能是通過(guò)菌血癥到達(dá)子宮內(nèi)，尤其是在有母親有牙周感染的情況下。由此可見(jiàn)，孕婦孕期口腔篩查及口腔健康維系非常重要。

2新生兒期

從出生時(shí)，嬰兒的口腔內(nèi)即出現(xiàn)微生物的定植，這一時(shí)期定植于口腔的微生物，并不會(huì)全部都在口腔中長(zhǎng)期的生存下來(lái)[8]，但先期定植微生物通過(guò)分泌及代謝產(chǎn)物等方式影響隨后定植的微生物種類。例如唾液鏈球菌作為新生兒口腔中最早定植的細(xì)菌之一，能夠產(chǎn)生胞外聚合物從而為其他細(xì)菌提供黏附位點(diǎn)。而這種微生物定植的早期區(qū)別能夠影響微生物后續(xù)定植并最終產(chǎn)生口腔成熟生態(tài)系的差別。那么，了解最初在口腔內(nèi)定植的微生物構(gòu)成，對(duì)研究口腔疾病的發(fā)生發(fā)展非常重要。不同的生產(chǎn)方式對(duì)嬰兒的口腔微生物定植產(chǎn)生不同的影響。LifHolgerson等[9]發(fā)現(xiàn)，不同生產(chǎn)方式的嬰兒口腔微生物可以顯著區(qū)分為2個(gè)類別。Dominguez-Bello等[10]發(fā)現(xiàn)，在出生后5min以內(nèi)，在新生兒身體上即發(fā)現(xiàn)細(xì)菌定植（口腔、鼻咽部、皮膚及腸道內(nèi)）。與母體身體不同部位高度分化的微生物定植情況不同的是，新生兒全身的微生物定植情況并沒(méi)有較大差異。順產(chǎn)的新生兒其微生物的定植與母體陰道的微生物定植情況相似，以乳桿菌屬、普雷沃菌屬及纖毛菌屬為主。剖腹產(chǎn)的嬰兒其微生物定植情況與母體皮膚相似，包括葡萄菌屬、棒狀桿菌屬及丙酸菌屬等。在出生后幾個(gè)小時(shí)以內(nèi)，新生兒的口腔即出現(xiàn)大量微生物定植，其來(lái)源為呼吸，喂食，與父母的接觸以及醫(yī)院內(nèi)接觸等。就在這段時(shí)期，口腔內(nèi)微生物的永久性定植開(kāi)始發(fā)生，在24h內(nèi)，口腔微生物的早期定植已經(jīng)出現(xiàn)，革蘭陽(yáng)性球菌，如鏈球菌及葡萄球菌等為優(yōu)勢(shì)菌。與成人相比較，3個(gè)月的嬰兒口腔微生物的豐富度明顯較低，但順產(chǎn)的嬰兒口腔中的微生物種類顯著多于剖腹產(chǎn)的嬰兒。剖腹產(chǎn)的嬰兒在口腔中具有獨(dú)有的Slackiaexigua菌，在76%的剖腹產(chǎn)嬰兒中，能夠檢測(cè)到其存在。Slackiaexigua是一種革蘭陽(yáng)性嚴(yán)格厭氧菌，在牙周炎，根管感染及腸膿腫中可以檢測(cè)到。雖然Slackiaexigua只能在剖腹產(chǎn)嬰兒口腔中檢測(cè)到的確切機(jī)制還并不清楚，但LifHolgerson等[9]推測(cè)順產(chǎn)嬰兒其口腔內(nèi)較多的微生物定植可能抑制了Slackiaexigua的生長(zhǎng)。隨著年齡增長(zhǎng)，嬰兒口腔內(nèi)的微生物群落也在進(jìn)化。隨著與外界環(huán)境接觸的增加，如進(jìn)食、與其他人或?qū)櫸锏慕佑|、衛(wèi)生習(xí)慣的建立等，在5個(gè)月的嬰兒口腔中，其口腔微生物已經(jīng)與母親出現(xiàn)明顯差異。Cephas等[11]通過(guò)454焦磷酸測(cè)序發(fā)現(xiàn)在無(wú)牙頜兒童中有99%的序列可以歸為以下6個(gè)門：厚壁菌門、變異菌門、放線菌門、梭桿菌門、螺旋體門及擬桿菌門。在無(wú)牙頜兒童及母體中，厚壁菌門、變異菌門、放線菌門及梭桿菌門均為優(yōu)勢(shì)菌門。在28個(gè)具有明顯差異的菌屬中，鏈球菌屬在嬰兒口腔中檢出率明顯高于成人，韋榮球菌屬、奈瑟菌屬、羅思菌屬、嗜血桿菌屬、孿生球菌屬、顆粒鏈菌屬、纖毛菌屬及梭桿菌屬也是嬰兒口腔中的優(yōu)勢(shì)菌，嗜血桿菌屬、奈瑟菌屬、韋榮球菌屬、梭桿菌屬、羅思菌屬、密螺旋體及放線菌是成人口腔的優(yōu)勢(shì)菌。雖然在嬰兒中能檢測(cè)到的口腔微生物較少，其口腔微生物的多樣性確比其父母更高。對(duì)于變異鏈球菌來(lái)說(shuō)，采用剖腹產(chǎn)出生的嬰兒感染變異鏈球菌的概率是順產(chǎn)嬰兒的11.7倍。在6個(gè)月大的嬰兒中，變異鏈球菌的感染率即高達(dá)50%，其感染的相關(guān)因素有高糖攝入，母乳喂養(yǎng)及與母體間的親密接觸等。在感染變異鏈球菌的嬰兒中，其母體的唾液中變異鏈球菌的含量普遍較高，同時(shí)口腔衛(wèi)生狀況差，高牙周炎患病率，較低的社會(huì)經(jīng)濟(jì)地位及較高的零食攝入次數(shù)均會(huì)導(dǎo)致變異鏈球菌的高感染率[12]。

3乳牙列期

乳牙的萌出對(duì)微生物的黏附和定植提供了新的生態(tài)位點(diǎn)，故其對(duì)口腔微生物構(gòu)成具有深刻的影響。在之前的研究中，有些學(xué)者曾將這一時(shí)期命名為“感染窗口期”，認(rèn)為某些致齲菌，如變異鏈球菌等只在這一時(shí)期才開(kāi)始定植。但最近的研究顯示[11]，早在無(wú)牙頜時(shí)期，就可以檢出上述菌屬，證明口腔軟組織可能起到很重要的“微生物儲(chǔ)備庫(kù)”作用，即使是無(wú)牙頜期兒童，其口腔衛(wèi)生維系仍然不可忽視。Xu等[13]采用454高通量測(cè)序?qū)θ檠懒袃和M(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)8個(gè)門，15個(gè)綱，21個(gè)目，30個(gè)科，41個(gè)屬的細(xì)菌微生物。無(wú)論是否有齲壞，兒童的口腔微生物中有99%的序列可以歸為5個(gè)門：厚壁菌門、變異菌門、放線菌門、梭桿菌門及擬桿菌門，以及7個(gè)屬：纖毛菌屬、鏈球菌屬、放線菌屬、普雷沃菌屬、卟啉單胞菌屬、奈瑟菌屬及韋榮球菌屬。Ling等[6]的研究結(jié)果也相似。乳牙萌出后，變異鏈球菌的感染率隨年齡增加而增加，2歲的嬰兒中，有81%感染變異鏈球菌[14]。在嬰兒中，感染變異鏈球菌的平均年齡為15.7個(gè)月，與變異鏈球菌感染相關(guān)的因素有入睡前含糖液體的攝入，高糖暴露率，零食攝入，與成人分享食物及母體唾液高變異鏈球菌水平等。與此同時(shí)，變異鏈球菌的低定植率與刷牙，抗生素?cái)z入等呈負(fù)相關(guān)。三歲時(shí)，兒童的唾液微生物群組構(gòu)成已經(jīng)非常復(fù)雜，但其微生物構(gòu)成在不同時(shí)期，如乳牙列期，混合牙列期及成人期仍在不斷變化。乳牙列期兒童較其他時(shí)期而言，其口腔微生物構(gòu)成中具有更多的不動(dòng)桿菌屬，莫拉菌屬，水棲菌屬等，而隨年齡增長(zhǎng)，從混合牙列期到成人期，在口腔微生物構(gòu)成中發(fā)現(xiàn)了更多了的韋榮球菌科微生物（韋榮球菌屬及月形單胞菌屬）及普雷沃菌屬，發(fā)現(xiàn)肉桿菌科（顆粒鏈菌屬）減少[15]。Kamma等[16]對(duì)4~5歲的乳牙列期兒童齦下菌斑進(jìn)行培養(yǎng)后，共發(fā)現(xiàn)41個(gè)菌種。而Gizani等[17]在乳牙列和混合牙列期兒童中，均可檢測(cè)到致齲菌，變異鏈球菌及血鏈球菌在軟組織，齦下菌斑及齦上菌斑中的檢出量隨年齡增加而顯著增加。致齲性鏈球菌在軟組織，唾液及舌體上比在牙面上更容易定植，這些部位可能是口腔致病菌的“儲(chǔ)藏庫(kù)”。

4混合牙列期

隨年齡增加，牙周可疑致病菌牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體、福賽斯坦納菌及4種橙色復(fù)合病原體含量也增加[18]。而Cortelli等[19]用PCR技術(shù)檢測(cè)無(wú)牙頜新生兒及混合牙列期兒童時(shí)，均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌。而齒垢密螺旋體均有檢出，提示在無(wú)牙頜期，即有齒垢密螺旋體的定植。在混合牙列期兒童中，直腸彎曲菌、中間普雷沃菌、福賽斯坦納菌、侵蝕艾肯菌等的檢出量明顯增多，提示這些細(xì)菌的大量定植與恒牙的萌出具有相關(guān)性。在混合牙列期兒童齦下牙周袋中，齒垢密螺旋體與福賽斯坦納菌檢出量呈現(xiàn)正相關(guān)，提示在無(wú)牙頜期齒垢密螺旋體的定植與牙萌出后福賽斯坦納菌的定植可能具有相關(guān)性。總的來(lái)說(shuō)，牙的萌出是口腔微生物定植的關(guān)鍵因素。在Cortelli等[20]的研究中，他們發(fā)現(xiàn)在0~4個(gè)月大的嬰兒中，即可檢測(cè)到直腸彎曲菌，說(shuō)明直腸彎曲菌的定植不依賴于牙萌出所提供的生態(tài)位點(diǎn)，牙齦卟啉單胞菌的定植是從混合牙列期到恒牙列期過(guò)渡時(shí)才開(kāi)始出現(xiàn)，福賽斯坦納菌及中間普雷沃菌定植的時(shí)間較早，從混合牙列期，恒牙開(kāi)始萌出時(shí)開(kāi)始定植。Sakai等[21]發(fā)現(xiàn)，在巴西混合牙列期兒童中有高達(dá)70%~80%的比例感染伴放線放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌及齒垢密螺旋體中的一種。但值得一提的是齒垢密螺旋體在日本混合牙列期兒童中并未被檢出，推測(cè)其定植可能有地域或飲食因素[22]。

5微生物在口腔不同部位的定植

由于口腔中多定植位點(diǎn)的存在，使口腔微生物組是人體中最為復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)。不同的生態(tài)定植位點(diǎn)、其氧壓力、營(yíng)養(yǎng)成分、溫度及宿主免疫體系均不相同[5]。在口腔基本所有的生態(tài)位點(diǎn)上，均有微生物定植，但其定植密度及成分各不相同。與黏膜及唾液相比較，牙面及舌部定居的微生物相對(duì)更多。在軟組織、唾液、舌部及齦上菌斑中，可以發(fā)現(xiàn)有更多的鏈球菌屬。輕型鏈球菌和口腔鏈球菌是軟組織中含量最大的微生物，唾液鏈球菌在唾液、軟組織及舌部也占有非常大的比例。放線菌屬在齦上及齦下菌斑中具有非常高的比例。而在舌部，可以找到更多的嗜乳酸桿菌及革蘭陰性桿菌[13]。唾液可以傳送游離出來(lái)的微生物，起到“傳輸帶”的作用，而舌背部等軟組織則在很大程度上起到“微生物儲(chǔ)備庫(kù)”的作用。某些微生物不僅可以在口腔軟組織面找到，還可以存在于人體上皮細(xì)胞中。如伴放線放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌及福賽斯坦納菌等可以協(xié)同作用共同進(jìn)入宿主上皮細(xì)胞內(nèi)。同時(shí)，在口腔上皮細(xì)胞內(nèi)不光能發(fā)現(xiàn)口腔致病菌，還能發(fā)現(xiàn)全身致病菌的存在，如在頰黏膜上皮中，發(fā)現(xiàn)金黃色釀膿葡萄球菌、糞腸球菌及綠膿假單胞菌的定植[23]。說(shuō)明口腔軟組織可能起到全身微生物“儲(chǔ)備庫(kù)”的作用。

6口腔微生物的傳播途徑

不同的口腔微生物來(lái)源均不相同。垂直傳播是口腔微生物傳播的一個(gè)重要途徑。母親及最初的撫養(yǎng)者是嬰兒及幼年兒童口腔微生物的最早來(lái)源[2]，如通過(guò)自然分娩，80%的母親陰道中的白假絲酵母菌能夠在新生兒中發(fā)現(xiàn)。而通過(guò)哺乳，母乳中特有的微生物也能傳播到嬰兒體內(nèi)[24]。30%~60%兒童口腔中的變異鏈球菌及伴放線放線桿菌與其父母親口腔中的基因型相同[25]。研究顯示，致齲菌的早期定植是齲病的高危因素之一，所以，對(duì)兒童的父母或是早期撫養(yǎng)者口腔健康的維系也應(yīng)該納入齲病防治的重點(diǎn)?？谇晃⑸锏乃絺鞑ヒ彩瞧鋫鞑サ囊淮笸緩?。在過(guò)去的30年里，整個(gè)社會(huì)及經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了非常大的變化，而這一變化對(duì)口腔微生物的構(gòu)成也會(huì)構(gòu)成非常重要的影響。在家里由家人撫養(yǎng)的兒童和在幼兒園生活的兒童其口腔微生物的來(lái)源非常不同，如在12~30個(gè)月大在幼兒園生活的兒童中，有29%口腔內(nèi)變異鏈球菌的基因型相同，而且與在家撫養(yǎng)的同齡兒童相比，他們與其母親口腔中變異鏈球菌的相似度顯著降低，提示了水平傳播的重要性?？傊?，在整個(gè)兒童時(shí)期，口腔微生物都在不斷地變遷，進(jìn)化及成熟?？谇晃⑸锏淖畛醵ㄖ?，與很多因素，如生產(chǎn)方式，接觸人群，喂養(yǎng)方式，生活環(huán)境等等均有相關(guān)。在不同牙列時(shí)期，口腔微生物定植具有其自身特點(diǎn)。目前的研究顯示，無(wú)論是在健康或是疾病狀態(tài)，口腔微生物中并沒(méi)有出現(xiàn)疾病相關(guān)“特異性致病菌”。如Ling等[6]用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳結(jié)合454焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)乳牙列期兒童的唾液及齦下菌斑進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在齲壞兒童中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異性致齲菌。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，10%的有齲兒童及青年人口腔內(nèi)沒(méi)有檢出變異鏈球菌，其齲壞的發(fā)生更可能是韋榮球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和丙酸菌屬，低pH值非變異鏈球菌類鏈球菌屬，放線菌屬共同作用而成。這提示，口腔微生物群落的整體作用，而非特定細(xì)菌的感染導(dǎo)致口腔感染性疾病如齲病等的發(fā)生。口腔正常菌群群落的定植和平衡對(duì)維持口腔及人體系統(tǒng)健康具有非常重要的意義。

作者：杜芹 鄒靜 李雨慶 李明云 周學(xué)東 單位：口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)） 四川省人民醫(yī)院口腔科