茶葉中吡蟲啉殘留量的測定檢驗方法

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1實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

Waters　ACQUITY　UPLCTM–TQD　MS／MS系統(tǒng)（美國waters）；高速勻質機（德國IKA）；氮吹儀（美國Organomation）；離心機（日本日立）；漩渦混合器（德國IKA）；電子天平（FA1104，上海天平儀器廠）等。阿維菌素標準品；吡蟲啉標準品（95％）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；乙腈（分析純）；固相萃取小柱：氨基炭黑柱（500mg／6mL）；水為二次蒸餾水。

1.2標準溶液的配制

精密稱量50．0mg阿維菌素和吡蟲啉原藥于100mL棕色容量瓶中，用甲醇（色譜純）溶解并定容，配制成500mg／L的標準儲備液。

1.3標準曲線

取阿維菌素和吡蟲啉標準儲備液，分別用甲醇稀釋配制成5ng／mL、10ng／mL、50ng／mL、100ng／mL、500ng／mL的標準工作溶液，經(jīng)液相色譜測定后建立兩種目標物濃度與峰面積的回歸方程。

1.4色譜質譜條件

色譜柱：UPLC　ACQUITY　BEH，50×2．1mm，1．7μm；采用乙腈和0．005mol／L乙酸銨溶液梯度洗脫，洗脫程0～1min，20％A；1～4min，90％A；4～5min，100％A；5～7min，20％A。流速：0．3mL／min；柱溫：40℃；進樣量：10μL離子源：ESI，正離子模式；毛細管電壓：4．0kV；離子源溫度：110℃；脫溶劑氣溫度350℃；脫溶劑氣流量：800L／hr；錐孔反吹氣流量50L／hr；錐孔電壓：40v；掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）；離子對：吡蟲啉，256／175．1（定量離子對），256／209；阿維菌素，890．5／305．2（定量離子對），890．5／567．3。

2分析步驟

2.1提取

準確稱取2．5g（精確至0．01g）均勻試樣，用5mL水將試樣潤濕，放置5min，加入5g無水硫酸鈉和15mL乙腈，渦動3min，超聲5min，5000r／min離心5min，將上清液轉移至濃縮瓶中。用10mL乙腈再提取一次，合并提取液。將提取液于50℃水浴下用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至近干，在殘渣中加入2．0mL甲醇＋二氯甲烷溶液，備用。

2.2凈化

將炭黑氨基柱用4．0mL甲醇＋二氯甲烷溶液（5＋95）預條件化，加入上述待凈化溶液，用10mL具塞試管收集，用2．0mL甲醇＋二氯甲烷溶液（5＋95）洗濃縮瓶后淋洗小柱，重復一次。將收集溶液置于50℃水浴中用氮氣吹干，殘渣用1．0mL乙腈溶解，在漩渦混合器上混勻，過0．2μm微孔水相濾膜后于高效液相色譜測定。

3結果與討論

3.1工作曲線

用流動相將混合標準溶液稀釋成5ng／mL、10ng／mL、50ng／mL、100ng／mL、500ng／mL，以峰面積為縱坐標，目標化合物的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。阿維菌素和吡蟲啉的相關系數(shù)分別為R＝0．9991和R＝0．9985，回歸方程分別為y＝2632x＋1033和y＝8150x＋229，在5ng／mL～500ng／mL范圍內，阿維菌素和吡蟲啉工作曲線線性良好，適合定量分析。

3.2液相色譜、質譜測定條件的優(yōu)化

阿維菌素和吡蟲啉的極性較弱，在反相色譜柱上的保留較強，因此選擇較高比例的乙腈作為強洗脫溶劑。母離子掃描顯示：阿維菌素和吡蟲啉在正離子模式下，目標物檢測離子以［M＋NH4］＋形式存在的量較多，在流動相中加入5mmol／L乙酸銨可促進母離子的形成。兩種化合物的保留時間、定量離子、定性離子、錐孔電壓及碰撞能量。

3.3凈化條件的選擇

由于茶葉中色素含量較高，所以選取了可以有效吸附色素的色譜柱。結果表明，炭黑氨基柱可以很好的吸附色素和其他雜質，同時，選用合適的洗脫液完全可以將兩種化合物洗脫，從而獲得較高的添加回收率。普通的氨基柱也可獲得較高的添加回收率，但由于不能吸附提取液中的色素，從而增加了對分析柱的污染及對儀器響應的干擾，而選用堿性氧化鋁柱和C18SPE柱時不論選擇哪種淋洗劑，回收率均小于60％。所以最終選用炭黑氨基柱。淋洗液選用甲醇和二氯甲烷，對二者比例進行了優(yōu)化，當甲醇和二氯甲烷的比例在1∶99到5∶95之間，回收率均能滿足要求，當甲醇和二氯甲烷的比例為5∶95時，回收率達到最大值。

3.4檢出限

聯(lián)合國糧食與農業(yè)組織（FAO）與世界衛(wèi)生組織（WHO）均未制定最高允許殘留限量，加拿大和澳大利亞規(guī)定油菜籽中最高殘留限量為0．05mg／kg。聯(lián)合國糧農組織和世界衛(wèi)生組織（FAO）所屬的食品中農藥殘留立法委員會（CCRPF）規(guī)定了阿維菌素的每日允許攝入量0．1μg／kg•bw，阿維菌素的最高殘留限量（MRL）為5μg／kg，美國農業(yè)部下屬的食品安全檢驗局（FSIS）規(guī)定的MRL值為20μg／kg，歐盟規(guī)定MRL值為0．02mg／kg。加拿大衛(wèi)生部EMRL2012－45號通報，有害生物管理局修訂了吡蟲啉的最大殘留限量。將吡蟲啉在蛋、豬、馬、牛、綿羊、山羊、家禽的脂肪、肉以及肉副產(chǎn)品中的最大殘留限量修訂為0．02×10－6，將吡蟲啉在干黃豆和奶類中的最大殘留限量分別修訂。

3.5方法的準確度與精確度

用上述試驗方法，在樣品中添加不同水平的阿維菌素和吡蟲啉混合標準溶液，進行添加回收率試驗，分別進行了5μg／kg、20μg／kg和100μg／kg三個添加水平的兩種目標化合物的加標回收實驗，每個水平重復測定6次，計算回收率和相對標準偏差，結果見表2。從表2可以看出，平均回收率范圍為81．4％～95．8％，RSD分別為2．0％～8．5％。

3.6應用

該方法已應用于茶葉中阿維菌素類藥物殘留的檢測。在對購自湛江市場的5份綠茶、5份紅茶、5份普洱茶的檢測中，只有其中一份綠茶檢測出10．4μg／kg的吡蟲啉。

4結論

本文建立了茶葉中阿維菌素和吡蟲啉的超高效液相色譜－串聯(lián)質譜方法。通過對提取與凈化方式進行探討與優(yōu)化，在一定程度上減少了茶葉基體對檢測的干擾。采用電噴霧電離源，在含有乙酸銨緩沖液的流動相條件下，以選擇信號強且穩(wěn)定的［M＋NH4＋］加合離子峰作為母離子，以基質校正曲線進行定量。方法穩(wěn)定、可靠、靈敏，能夠滿足國內外法規(guī)對茶葉中阿維菌素和吡蟲啉殘留的限量要求，可用于茶葉中阿維菌素和吡蟲啉兩種農藥殘留的檢測與確證。

作者：王立一 楊春亮 王曉芳 單位：中國熱帶農業(yè)科學院農產(chǎn)品加工研究所