生物醫(yī)學(xué)雞胚運用分析

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1資料和方法

1.1資料來源

由第一作者在2011-06進行檢索。檢索數(shù)據(jù)庫：PubMed數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)址www.ncbi.nlm.gov/PubMed；CNKI數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)址www.cnki.net/；英文資料的檢索時間范圍為1967/2011；中文資料的檢索時間范圍為1990/2011。英文檢索詞為“chickenembryochorioallantoicmembranemodel;neuronalculture”；中文檢索詞為“雞胚絨毛尿囊膜，模型；神經(jīng)細胞培養(yǎng)”。

1.2入選標準

納入標準：①雞胚培養(yǎng)方法的應(yīng)用。②神經(jīng)細胞培養(yǎng)的研究。③疾病模型。排除標準：①與此文目的無關(guān)。②較陳舊的文獻。③重復(fù)同類研究。

1.3質(zhì)量評估

基礎(chǔ)研究和疾病模型研究原著163篇，綜述40篇，述評2篇。

2結(jié)果

2.1納入文獻

基本情況初檢得到205篇文獻，中文123篇，英文82篇。閱讀標題和摘要進行初篩，排除因研究目的與此文無關(guān)112篇，內(nèi)容重復(fù)性的研究59篇，共保存34篇中英文文獻做進一步分析。文獻[1-2]研究了雞胚的組織結(jié)構(gòu)特點，文獻[3-30]篇分析了雞胚在腫瘤研究、病毒培養(yǎng)、藥物作用研究領(lǐng)域的應(yīng)用，文獻[31-34]篇利用雞胚研究了氧化應(yīng)激模型及子宮內(nèi)膜移位癥雞胚模型。

2.2結(jié)果描述

2.2.1雞胚的組織結(jié)構(gòu)特點雞胚一般是雞的受精卵從開始孵化到雛雞的階段，該階段20~21d。雞胚有3個胚層發(fā)育而成，在發(fā)育的不同階段具有不同的結(jié)構(gòu)特點。實驗中應(yīng)用第5~11天的雞胚較多，在該階段雞胚具有胚體、羊膜、絨毛膜、尿囊和卵黃囊等結(jié)構(gòu)，外面被覆殼膜和殼。第10天絨毛膜與尿囊合并為絨毛尿囊膜，主要由3層構(gòu)成：外胚層，緊貼殼膜，由一到兩層絨毛膜上皮構(gòu)成；中胚層，富含大量毛細血管和間質(zhì)細胞；內(nèi)胚層，面向尿囊腔，是一層扁平的內(nèi)皮。絨毛尿囊膜緊貼多孔的殼，其中的血管網(wǎng)通過尿囊動脈和靜脈與胚體的循環(huán)相連，是雞胚的呼吸器官。該結(jié)構(gòu)保證了足夠的氣體和養(yǎng)分交換，也使其能夠有效的支持移植物的生長，從而成為多種實驗的良好模型。卵黃囊是雞胚的營養(yǎng)器官，含有豐富的血管網(wǎng)為雞胚提供營養(yǎng)物質(zhì)。雞胚的免疫系統(tǒng)由T細胞介導(dǎo)的細胞免疫和B細胞介導(dǎo)的體液免疫構(gòu)成。B細胞在相當與哺乳動物骨髓的法氏囊中分化，T細胞在胸腺分化。至孵育的第10天，雞胚的免疫系統(tǒng)尚未完全建立，孵育的第11天后才能檢測到T細胞和B細胞[2]，至第18天免疫系統(tǒng)方初步建立。這一特點使雞胚在孵育的早期不對異物產(chǎn)生排異反應(yīng)，有利于移植物的生長。

2.2.2雞胚在腫瘤研究領(lǐng)域的應(yīng)用雞胚在腫瘤研究中的應(yīng)用主要有腫瘤血管生成，腫瘤種植與轉(zhuǎn)移，腫瘤侵襲等方面。目前認為腫瘤的血管生成在腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移中起主要作用。腫瘤的生長需要新生血管來提供養(yǎng)分，氧氣和排泄代謝廢物。如果沒有新生血管形成，原發(fā)腫瘤的大小一般不超過2mm×2mm×2mm。對腫瘤血管生成的研究分為促進血管生成和抑制血管生成兩個方面。血管生成的反應(yīng)表現(xiàn)為圍繞移植物的輻輳放射狀血管生成和血管密度增加[3]；抑制血管生成的反應(yīng)為血管減少，密度降低直至消失。Vacca等[4]用絨毛尿囊膜模型來研究漿細胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)血管生成的能力，發(fā)現(xiàn)活動性骨髓瘤患者的條件培養(yǎng)基較非活動性骨髓瘤患者的條件培養(yǎng)基能顯著促進血管的生成。他們還進一步發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤的促血管生成反應(yīng)和某些內(nèi)源性血管生成抑制因子的缺失有關(guān)[5]。Ribatti等[6]通過把不同神經(jīng)母細胞瘤患者的活檢腫瘤組織移植入絨毛尿囊膜，證實有癌基因MYCN擴增者比無MYCN擴增者具有更顯著的促血管生成作用。Kern等[7]應(yīng)用絨毛尿囊膜模型研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米(bortezomib,蛋白酶體抑制劑)有很強的抗血管生成作用，但這一作用可以被GRP-78因子所拮抗。通過構(gòu)建各種腫瘤的絨毛尿囊膜模型，雞胚在腫瘤的種植與轉(zhuǎn)移的研究中也有廣泛的應(yīng)用。絨毛尿囊膜模型最早由Knighton等[8]提出，近年來國內(nèi)外學(xué)者已成功的建立卵巢癌絨毛尿囊膜模型[9]、胃癌絨毛尿囊膜模型[10]、前列腺癌絨毛尿囊膜模型[11]，鼻咽癌絨毛尿囊膜模型[12]，骨肉瘤絨毛尿囊膜模型等[13]。腫瘤組織來源不同構(gòu)建模型所需最佳條件有所區(qū)別，有文獻報道黑色素瘤細胞株、前列腺癌細胞株接種細胞數(shù)在105~106就可以有較好的成瘤效果[11,14]；膽管癌細胞須在4×106時才能較好的形成移植瘤[15]；卵巢癌要求更高，需要107~108才形成移植瘤[10]；所以在建立不同腫瘤細胞的絨毛尿囊膜模型時要首先摸索出模型建立的最佳條件。這些模型的建立對研究腫瘤的種植與轉(zhuǎn)移提供了很好的在體模型。Taizi等[16]利用白血病絨毛尿囊膜模型，通過DNA的定量分析，研究了白血病對各個臟器的侵襲情況。也有學(xué)者運用絨毛尿囊膜模型研究了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如癌細胞通過循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到靶器官[17]；轉(zhuǎn)移的癌細胞通過血管壁轉(zhuǎn)移到細胞間質(zhì)和靶器官[18]；腫瘤細胞在靶器官內(nèi)的增殖等[19]。

2.2.3雞胚在病毒培養(yǎng)疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用雞胚適于部分敏感病毒的生長，長期以來被大量用于流感病毒等的培養(yǎng)和疫苗的生產(chǎn)。應(yīng)用雞胚材料進行病毒培養(yǎng)有兩種方法：一種是直接接種在雞胚的不同部位，如尿囊腔、羊膜腔等；一種是接種在體外培養(yǎng)的雞胚細胞中，如成纖維細胞。郭芳等[20]應(yīng)用雞胚尿囊腔和羊膜腔接種法比較了流感病毒的雞胚培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)兩種分離方法的異同。發(fā)現(xiàn)雞胚培養(yǎng)法較細胞培養(yǎng)法具有病毒易復(fù)制，接種部位病毒含量大，對病毒不產(chǎn)生抗體，來源充足，操作簡單等優(yōu)點。Meyer等[21]利用原代雞胚成纖維細胞培養(yǎng)修飾的安卡拉痘苗病毒，經(jīng)過一系列的傳代得到了安卡拉痘苗。萬學(xué)勤等[22]也利用雞胚成纖維細胞培養(yǎng)新城疫病毒來進行抗腫瘤新城疫病毒疫苗的研究。富強等[23]從細胞病變和抗原滴度兩個方面比較了雞胚肝細胞培養(yǎng)禽腺病毒和SPF雞腎細胞培養(yǎng)禽腺病毒，兩者并無明顯差異，可以用雞胚肝細胞培養(yǎng)禽腺病毒來替代傳統(tǒng)的SPF雞腎細胞培養(yǎng)法。黃杰庭[24]利用SPF雞胚進行了中國首例甲型H1N1病毒的分離培養(yǎng)和鑒定。目前常用的疫苗中有些是通過病毒接種雞胚培養(yǎng)法生產(chǎn)的，但是并非所有世界衛(wèi)生組織公布推薦的疫苗株在雞胚培養(yǎng)的過程中都具有良好的病毒復(fù)制能力。研究發(fā)現(xiàn)在雞胚中能夠良好復(fù)制的流感毒株通常在HA蛋白基因序列上和能夠在人群中流行的毒株存在一個或多個氨基酸位點差異[25]。尋找在雞胚中復(fù)制良好的高產(chǎn)株或者通過不同毒株之間的重配來獲得在雞胚上有良好復(fù)制能力的毒株也是目前利用雞胚生產(chǎn)疫苗研究的熱點。

2.2.4雞胚在藥物作用研究中的應(yīng)用雞胚在藥物作用的研究主要有抗腫瘤藥物和活血化瘀中藥的研究。有學(xué)者利用黑色素瘤絨毛尿囊膜模型研究了內(nèi)皮抑素和多西環(huán)素對腫瘤血管生成的影響[26]。李穎嘉等[27]過骨肉瘤OS-732細胞絨毛尿囊膜模型研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子抗體對骨肉瘤血管生成及腫瘤增殖、凋亡狀態(tài)均有顯著影響；血管內(nèi)皮生長因子抗體組腫瘤去血管數(shù)目及瘤細胞數(shù)顯著低于PBS對照組。Amin等[28]通過絨毛尿囊膜模型研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸能抑制50%以上的胚胎血管形成，使損傷修復(fù)血管形成中所需要的纖維蛋白的形成減少30%以上。同時發(fā)現(xiàn)能使乳腺癌的生長減少15%，微血管密度下降20%。提示甘氨酸具有抑制胚胎血管形成，抑制損傷修復(fù)和腫瘤生長的作用。李漢青等[29]應(yīng)用絨毛尿囊膜模型用pH梯度法對復(fù)方三黃膠囊抑制腫瘤血管生成的活性部位進行了比較，發(fā)現(xiàn)用乙酸乙酯萃取的酸性部位復(fù)方三黃膠囊具有顯著的抑制雞胚絨毛尿囊膜細小毛細血管的作用。董紀軍等[30]用雞胚心侵襲實驗法研究了雌二醇對SAcc83細胞轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)雌二醇對SAcc83細胞有明顯的促增殖和轉(zhuǎn)移作用。

2.2.5雞胚在其他生物醫(yī)學(xué)實驗中的應(yīng)用雞胚還被用于其他研究中，如子宮內(nèi)膜移位癥雞胚模型。Maas等[31]利用該模型研究了子宮內(nèi)膜細胞的種植侵襲過程。俞超芹等[32]研究了葛根素對子宮內(nèi)膜異位癥細胞惡性行為的調(diào)控機制，結(jié)果顯示葛根素能明顯抑制種植內(nèi)膜囊泡及周邊血管形成，可以明顯上調(diào)EM在位基質(zhì)細胞凋亡基因BAD、BAX、CASP8、CASP9和TNFRSF6的表達，并增強細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子CDKN1B、CDKN2A及IFNA1、IFNB1基因表達；減少癌基因FOS、CHEK2、SRC和黏附侵襲基因ITGB5、MMP9及生長、轉(zhuǎn)錄因子基因PDGFA、NFKBIA表達。為了探討氧化應(yīng)激對胚胎發(fā)育的不良影響，研究疾病的發(fā)生機制，篩選和評價藥物活性，利用各種應(yīng)激原負荷建立了不同的雞胚氧化應(yīng)激模型[33]。也有學(xué)者利用雞胚背根神經(jīng)節(jié)與前腦細胞體外培養(yǎng)來研究神經(jīng)損傷修復(fù)與評價神經(jīng)生長因子的作用和神經(jīng)營養(yǎng)藥物的效果[34]。

3展望

如能充分利用雞胚的培養(yǎng)體系，則能為多領(lǐng)域的研究提供切實可行的方法與思路。目前神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)作為一種基本的實驗手段在神經(jīng)生物學(xué)及細胞生物學(xué)界備受重視，借助神經(jīng)細胞培養(yǎng)，不但可以了解神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)育過程，而且可探討細胞因子對神經(jīng)元存活、生長的影響。但神經(jīng)細胞是終末分化細胞，不能繼續(xù)增殖，對培養(yǎng)條件要求較高，技術(shù)要求嚴格，如能利用雞胚培養(yǎng)構(gòu)建神經(jīng)細胞的培養(yǎng)模型，則能為神經(jīng)科學(xué)的教學(xué)與科研提供一種價格便宜，操作簡便，容易獲得，周期短的新方法與途徑。