口腔種植體體內生物學評價方法的研究

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【摘要】口腔種植體的體內生物學評價主要是通過動物實驗獲得種植體的生物安全性、骨結合效能及穩(wěn)定性等相關生物學指標，為種植體表面處理改進、結構設計優(yōu)化、縮短負重時機等提供科學依據。目前，鮮有報道，本文對有關口腔種植體的體內生物學評價方法進行綜述。

一、大體觀察

在對動物進行種植手術前應確保實驗動物無任何不良反應或系統(tǒng)性疾病，種植位點近遠中間隙及頜齦間隙量足，黏膜無明顯紅腫或異常滲出，咬合關系無明顯異常，無明顯骨壁缺損，盡量統(tǒng)一入組標準。術中及時對動物呼吸、脈搏、心率等生命體征進行檢測，防止動物意外死亡。術后按照實驗設計定期觀察并記錄種植位點傷口愈合情況、黏膜情況以及種植體有無松動脫落等。另外部分學者用鑷子等金屬器械叩擊種植體，通過聲音及手感對種植體穩(wěn)定性作出定性評價，但此法重復性差，主觀性強、測量結果可靠性較低［3］。

二、牙周健康指標評價

種植體的牙周健康指標能夠反映種植體在口內的長期穩(wěn)定性［4］。根據不同的實驗設計，檢查種植體周圍探診深度(probingdepth，PD)，牙齦指數(gingivalindex，GI)，探診出血指數(bleedingonprobing，BOP)，改良出血指數(modifiedsulcusbleedingindex，mSBI)，種植體松動度以及邊緣骨吸收程度等指標，來反映種植體在動物體內周圍軟硬組織的生理變化，評價新型種植體與對照植體的優(yōu)缺點。目前種植體失敗的主要原因是種植體周圍炎［5］。以上牙周指標能夠對種植體周圍炎的發(fā)生作出客觀定量的評價。

三、實驗室檢查

國際標準化組織(ISO)文件指出，種植體、修復用合金等17種應用于機體與生物組織直接接觸的生物醫(yī)用材料需要進行相應的實驗室檢查，為材料的生物安全性提供科學依據［6］。動物的體內實驗室檢查主要在種植手術前、后2個階段進行，術前各項指標檢測作為對照組以排除由于動物本身全身系統(tǒng)性或代謝性疾病導致的誤差。實驗室檢查的項目主要包括血常規(guī)、尿常規(guī)、便常規(guī)、血氣分析、血電解質、肝功能、腎功能、血脂、心肌酶、甲狀腺功能、血糖以及血清免疫學檢測等。在新型種植體植入前后，比較動物各項檢查指標統(tǒng)計學差異，另外也可以與臨床中已經使用的種植體做橫向對比，討論新型種植體的生物安全性。除以上體內實驗外，種植體的體外實驗，包括:溶血實驗、細胞毒性實驗等因其操作簡單、靈敏、重復性好、費用低廉可部分代替體內實驗。同時為確保生物材料安全性，節(jié)約實驗時間，通常應先進行體外檢測［7］。近幾年隨著對種植體周圍炎的研究逐步深入，部分學者提出齦溝液中的一些細胞因子是種植體周圍炎的啟動因子，例如白介素(interleukin，IL)-17A、IL-35和IL-8等［8］，另外，Niimi等［9］通過臨床試驗認為種植體周圍齦溝液的量可以反映種植體周圍軟組織的炎癥程度，因此可以監(jiān)測種植體周圍齦溝液特異性細胞因子和量的表達，進而反映種植體的炎癥狀態(tài)。

四、影像學檢查

影像學檢查能夠在無創(chuàng)條件下，對種植體的位置、周圍頜骨形態(tài)、骨質密度、不同時點骨吸收程度等進行定量評價。根尖片由于其價格低廉、操作簡單、放射劑量小，在種植體的臨床試驗中更易被患者接受。但是，由于對拍攝角度、曝光量和沖洗條件較難統(tǒng)一調控，導致根尖片檢查的可重復性較差［10］。另外，與錐形束CT(CBCT)、顯微電子計算機斷層攝影(Micro-CT)、核磁共振成像(MRI)相比，根尖片對種植體周圍骨密度、骨量吸收、骨小梁排列等細節(jié)成像清晰度較差。CBCT在種植臨床術前評估中應用廣泛，它能夠清楚的顯示復雜細小的解剖結構，如頦管、副頦管和副頦孔、上頜竇壁、血管、顳下頜關節(jié)、骨小梁、下頜切牙管、舌孔和舌管、根管、牙周組織等［11］。相比傳統(tǒng)多排螺旋CT，CBCT具有放射劑量低、空間分辨率高、全部1∶1成像、影像細致分明等優(yōu)勢。在動物實驗中，CBCT可以定量監(jiān)測種植體植入后邊緣骨吸收情況，并三維重建種植體在骨內位置，合理的評價種植體長期穩(wěn)定性。Micro-CT的辨析率能達到14μm，相比CBCT對種植體周圍組織顯像更加細致［12］。計算骨-種植體接觸比率曾被認為是觀察骨-種植體界面狀態(tài)的最客觀及直接的方法，但缺點是組織切片為二維圖像，所得數據不夠準確。隨著Micro-CT技術的逐漸成熟，已有一部分學者開始利用Micro-CT的高分辨率及三維立體成像的優(yōu)勢，來分析骨-種植體界面，并計算骨-種植體的三維接觸比率［13］。另外Micro-CT可以對骨體積、骨密度、骨小梁分離度、骨小梁厚度等進行定量評價，便于實驗數據統(tǒng)計分析。為了獲得精確的實驗結果，使用Micro-CT檢測的實驗標本最好在動物處死后，取種植位點局部頜骨標本，并用保鮮膜包裹，以免標本脫水干燥而影響組織結構觀察［14］。純鈦金屬材料種植體的MRI兼容性已經得到大部分基礎實驗及臨床實驗證實［15］。MRI不僅能夠提供組織精細的解剖影像，而且能對軟硬組織中病灶進行精確的定位，但純鈦種植體在MRI檢查中，對其周圍軟組織成像仍有一定偽影，并且偽影面積大小與種植體體積有關［16］。動物體內實驗中較少使用MRI檢測種植體周圍軟硬組織變化，通常使用MRI來評價新型種植體的體內兼容性，檢測偽影面積對周圍軟硬組織的影響程度。

五、骨結合效能檢測

骨結合是種植體負重的基礎，骨結合效能能夠反映種植體長期穩(wěn)定性、種植體結構設計是否合理以及種植體表面處理工藝的優(yōu)良。研發(fā)種植體中對骨結合的檢測至關重要。種植體與骨界面之間的應力分為壓應力、拉應力和剪應力，分別用推出實驗、抗拔實驗和扭轉實驗檢測［17］。推出實驗是利用萬能實驗機將標本固定后，沿種植體長軸方向按一定速率加壓，直至種植體被推出?？拱卧囼炇歉鶕嶒炘O計在規(guī)定的時間點，用萬能實驗機固定骨塊標本和種植體修復基臺，沿種植體長軸方向以一定速率加載拉力，記錄即刻拔出作用力。扭轉實驗在骨結合力的檢測中最為常見，它通常用于螺紋形種植體的生物力學測試，而現在大多數種植體表面均有螺紋［18］。扭轉實驗是用萬能實驗機固定標本和種植體后，逆時針旋轉直至種植體旋出，通過計算機記錄每個種植體的扭矩曲線。在扭矩曲線上可以確定骨-種植體界面破壞時的屈服點，得出相應的臨界扭矩值。Cornelissen等［19］認為骨-種植體界面的剛性反映骨結合的成熟程度。連接牙種植體表面與周圍骨組織發(fā)生直接的生物性鎖結是保證種植修復義齒成功的基礎，種植體在植入后，種植體周圍新形成的骨組織逐漸增多并不斷成熟，界面的剛性也逐漸增大。

六、牙周測試儀檢查

牙周測試儀能夠測量種植體骨結合的穩(wěn)定性，數據具有客觀可重復性，不會因操作者不同而出現統(tǒng)計學意義上的顯著差異［20，21］。但因其測量耗時，使用時需叩擊種植體，對于種植體植入早期時會產生震蕩，影響初期穩(wěn)定性，故無法全程檢測種植體的骨結合情況，現已較少使用。

七、組織學評價

種植體研發(fā)中組織學評價的應用比較廣泛。帶種植體的骨組織標本最好制作為不脫鈣磨片，因其完整的保存了骨組織的礦化結構，標本染色后可較為清楚的在種植體周圍顯示新生骨所在區(qū)域，有利于骨形態(tài)參數的測量［22］。染色方法一般選擇亞甲基藍-堿性品紅法、甲苯胺藍染色法、Coldner’s三色法。不同染色方法顯色情況及優(yōu)缺點如下:①亞甲基藍-堿性品紅法將成骨細胞染為深藍色、類骨質為藍綠色、骨組織為紫色，該染色方法在種植體周圍觀察新生成骨細胞更加清晰;②甲苯胺藍染色法將骨組織染為藍色，將纖維染成白色，該染色方法主要顯示新生骨的成骨情況;③Coldner’s三色法將成骨細胞染為桔黃色、新生礦化骨為藍綠色或亮藍色、成熟骨組織為綠色。在新骨礦化的各個階段，Coldner’s三色法對種植體周圍成骨細胞、類骨質、礦化骨均有清晰的顯色。3種顯色方法中，Coldner’s三色法更適合區(qū)分礦化骨和未礦化骨，以及觀察種植體周圍骨礦化各個階段的形態(tài)學變化;亞甲基藍-堿性品紅可用來定量統(tǒng)計種植體周圍成骨細胞的情況;甲苯胺藍染色可以與其他染色方法配合進行種植體-骨結合表面新骨形成面積研究的參照［23，24］。

八、電鏡觀察

電鏡觀察最大的優(yōu)勢是能夠觀察種植體骨界面的超微結構，成像更加立體、細致和真實［25］。不同種類的電鏡觀察方法如下:掃描電鏡分辨率高，除了能夠觀察種植體骨界面超微結構外，還能夠配備X射線能譜儀和X射線波譜儀對標本進行定性和無標樣定量分析。另外掃描電鏡能夠測量種植體-骨接觸率及種植體與骨之間的間隙距離。種植體與骨之間的間隙距離通常取同一倍數下種植體與骨之間的最大間隙、中等間隙和最小間隙，最后取平均值。透射電鏡采用低溫離子減薄制片技術，用PhlipsEM-430和X射線雙晶衍射儀進行觀察分析，界面形成骨組織的標志是出現大小不一的高電子密度鈣球或一體化骨鈦復合體，通過統(tǒng)計鈣球密度和骨鈦復合體面積，評價種植體骨結合程度［26］。

九、共振頻率分析

近幾年來，共振頻率(RFA)分析技術在臨床中用來評價種植體穩(wěn)定性，取得了良好的效果［27］。RFA的原理是通過激發(fā)與種植體相連的懸臂梁，通過儀器計算懸臂梁的共振頻率進而代表種植體的穩(wěn)定性，所測得的種植體穩(wěn)定數值稱為ISQ值，該值越大，代表種植體的穩(wěn)定性越好［28］。RFA是一種非破壞性的種植體評價方法，無需敲擊種植體，且RFA測量過程不會影響正常的組織愈合，因此RFA可用于種植體骨整合階段的全程定量監(jiān)測［29］。

十、口腔黏膜刺激實驗

口腔黏膜刺激實驗是根據ISO7405-1997國際標準設計的，用來評價與口腔黏膜短期或長期接觸的材料對黏膜產生的刺激作用，該實驗被國際標準化組織列為評價口腔材料生物安全性的必需實驗［30］。種植體的生物安全性至關重要，可將種植體縫合固定在動物頰粘膜上，觀察不同時點黏膜組織代謝情況，為種植體的生物安全性提供科學依據。綜上所述，口腔種植體研發(fā)的體內生物學評價方法多種多樣。在研究中，應根據實驗目的合理選擇檢測方法，其中，影像學檢查和共振頻率分析是檢測種植體骨結合過程中比較精確的方法，種植體旋轉實驗和組織學評價能夠定量反映出種植體骨結合效能。因此，筆者認為以上4種方法在種植體評價方法中尤為關鍵。骨結合和生物安全性兩個方面是體內評價的重要內容，如何能夠實現在無創(chuàng)條件下，更加直觀、準確、高效的評價種植體的骨結合程度和結構設計是否優(yōu)良，并將其用于臨床實踐中仍有待于研究。

作者：王凌霄 高振華 李鈞 單兆臣 單位：首都醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院種植中心