蛋白電泳測(cè)量運(yùn)用計(jì)算機(jī)掃描法

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本文作者：林林、何廣源 單位：曾廣東省順德中醫(yī)院檢驗(yàn)科

1材料與方法

1．1標(biāo)本來源

取自陸軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科常規(guī)檢查健康人血清30份。

1．2儀器與試劑

電泳儀1套；計(jì)算機(jī)（帶有Windows操作系統(tǒng)和安裝Adopephotoshop及Excel等軟件）1臺(tái)，掃描儀1臺(tái)（光學(xué)分辨率在1000dpi，吸光度2．8以上）醋酸纖維薄膜等。巴比妥緩沖液（pH8．6離子強(qiáng)度為0．06mol／L）；配置好后用1mol／L氫氧化鈉（NaOH）溶液調(diào)節(jié)pH值至8．6。染色液：0．1％氨基黑10B，漂洗液：取蒸餾水800mL、甲醇50mL及冰醋酸150mL混合而成。透明液：石蠟油透明液。

1．3操作

參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》蛋白電泳操作方法［1］，對(duì)點(diǎn)樣和透明掃描幾個(gè)步驟加以改進(jìn)。

1．3．1自行制備點(diǎn)樣器

（1）常規(guī)分析（剪切后用NaOH浸泡洗脫比色法）：先用砂輪將蓋玻片打磨平滑，再用兩塊載玻片夾住蓋玻片，露出1cm，用透明膠紙綁緊就成了一個(gè)很好的加樣器了。（2）掃描法：把蓋玻片截掉一半，用同樣的方法綁緊。或者剪取3cm×1cm的濾紙條，加樣效果也不錯(cuò)。

1．3．2透明

將脫色吹干后的薄膜浸入透明液中，約10min薄膜完全透明，然后將膜條置于潔凈、干燥的玻璃板或透明膠片上［2－3］。

1．3．3掃描

用高分辨率掃描儀透射掃描薄膜［4］，分別對(duì)血清中清蛋白（ALB）及α1、α2、β、γ球蛋白5種成分進(jìn)行掃描分析。掃描條件為500dpi，保存為RBG模式tiff文件。

1．3．4應(yīng)用

Adopephotoshop軟件，將每個(gè)圖像分10×100個(gè)區(qū)間，并用ImageTool圖像分析軟件分析信息參數(shù)分別記錄各區(qū)間的C、N、Y、K、∑、R、L、a、b等圖像色譜參數(shù)數(shù)據(jù)，將上述參數(shù)導(dǎo)入Excel電子表格中，運(yùn)用Excel的引入函數(shù)，插入圖表，識(shí)別低段等功能，可以畫出蛋白質(zhì)組分分布曲線，百分含量。

1．4方法學(xué)評(píng)價(jià)

采用配對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)，以陸軍總醫(yī)院Sebia全自動(dòng)蛋白電泳分析儀為參照，分別比較掃描法和常規(guī)法與Sebia蛋白電泳儀檢測(cè)結(jié)果之間的差異，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

掃描法和常規(guī)法與Sebia蛋白電泳儀檢測(cè)結(jié)果之間的差異分別見表1、2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，掃描分析測(cè)定法與Sebia蛋白電泳儀檢測(cè)結(jié)果不存在差異，以Sebia全自動(dòng)蛋白電泳儀檢測(cè)結(jié)果為參照，掃描分析測(cè)定法在方法學(xué)上，可以接受，各項(xiàng)t值均小于常規(guī)法，而且在操作上省去了剪切、洗脫、比色等煩瑣工夫，避免因此而帶來的誤差。

3討論

3．1本實(shí)驗(yàn)方法在電泳的前期操作與改良的常規(guī)方法一樣［5］，后期的檢測(cè)法是根據(jù)電泳圖譜的色深（吸光度值）直接反映了該區(qū)帶蛋白質(zhì)的含量，透明膠片的色深與數(shù)字化圖譜的RBG信息參數(shù)呈反相關(guān)，與油墨量∑和L（灰度）呈正比（用油墨量∑為參數(shù)的分析結(jié)果與Sebia結(jié)果最為符合）。由于蛋白分析是測(cè)其相對(duì)含量，通過分析其色譜參數(shù)可計(jì)算出蛋白各組分的相對(duì)含量百分比。采用了計(jì)算機(jī)Adopephotoshop應(yīng)用軟件和ImageTool圖像分析軟件（試用版）以及Excel電子表格統(tǒng)計(jì)軟件分析系統(tǒng)，但現(xiàn)在幾種軟件中的綜合使用會(huì)帶來工作量的增加，分析時(shí)間較長(zhǎng)，離實(shí)際應(yīng)用還有一段距離，這要求檢驗(yàn)人員必須與軟件專業(yè)人員一起自行研究編寫一種應(yīng)用。軟件該軟件能直接將圖像色譜信息參數(shù)記錄下來，并用相應(yīng)的計(jì)算分析軟件（可以是Excel，也可以是其他數(shù)據(jù)分析軟件）分析圖像色譜參數(shù)，從而計(jì)算出蛋白質(zhì)各組分的百分含量，真正做到圖像處理、分析、計(jì)算一體，其經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益是非常有前景的。

3．2蛋白電泳的分離效果直接影響到分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，因此往后研究工作的重點(diǎn)在提高電泳的分離質(zhì)量［6］。總結(jié)起來，主要有如下幾方面：（1）是電泳支持物的選擇上，可以比較瓊脂糖凝膠與醋纖維膜的分離效果和穩(wěn)定性。（2）是加樣的方法上可以借鑒全自動(dòng)蛋白電泳儀的加樣裝置，選擇質(zhì)地均勻、吸水性能好、蛋白質(zhì)電滲作用小的濾紙，當(dāng)然還要考慮硬度和厚度等因素，可制成一排多個(gè)標(biāo)本的加樣器。（3）是可購(gòu)買較高配置的電泳儀，使電泳電流、電壓穩(wěn)定，增大可調(diào)電壓范圍。