宮頸癌端粒酶活性與患者診斷預(yù)后關(guān)系

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【摘要】目的探討宮頸癌人端粒酶RNA(hTERC)擴增和人端粒酶催化單位(hTERT)的表達(dá)與患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的關(guān)系。方法選取2010年6月～2013年6月該院接受手術(shù)切除子宮的宮頸癌患者45例為觀察組，因子宮肌瘤行子宮切除的正常宮頸組織患者45例為對照組。采用熒光免疫原位雜交和Westernblot檢測兩組hTERC擴增和hTERT蛋白質(zhì)水平變化，并根據(jù)hTERC擴增情況比較陰性和陽性患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的變化。結(jié)果觀察組宮頸癌組織中hTERC擴增陽性率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Westernblot分析顯示，觀察組患者宮頸癌組織中hTERT蛋白質(zhì)水平較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。hTERT蛋白質(zhì)陽性患者術(shù)后1年、2年和3年累積復(fù)發(fā)率明顯高于陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，陽性患者術(shù)后1年、2年和3年累積生存率明顯低于陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論宮頸癌腫瘤組織中端粒酶處于激活狀態(tài)，可作為診斷宮頸癌的輔助指標(biāo)，同時可能與患者術(shù)后預(yù)后有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】宮頸癌;端粒酶;術(shù)后累積復(fù)發(fā)率;累積生存率

近年來提出的端粒酶假說是細(xì)胞癌變的早期事件，有望成為宮頸癌早期診斷的輔助標(biāo)志〔1－2〕。端粒酶活性主要依賴于2個基因的表達(dá)，人端粒酶催化單位(hTERT)和人端粒酶RNA(hTERC)。研究顯示〔3－4〕，端粒酶活性在許多腫瘤組織(乳腺癌、肺癌)中處于激活狀態(tài)，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。有研究也顯示〔5〕，端粒酶在宮頸癌腫瘤組織中表達(dá)陽性率較高，但對其在患者術(shù)后預(yù)后方面的報道較少。本研究系統(tǒng)分析端粒酶活性在宮頸癌早期診斷和預(yù)后方面的價值。

1資料與方法

1.1資料

選取我院2010年6月～2013年6月收治的因手術(shù)切除子宮的宮頸癌患者45例為觀察組，因子宮肌瘤行子宮切除的正常組織患者45例為對照組。觀察組年齡51～69歲，平均年齡(60.4±8.4)歲;對照組年齡50～71歲，平均年齡(61.4±9.4)歲;兩組患者年齡、性別等差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):①所有患者均經(jīng)病理學(xué)和陰道鏡檢查進(jìn)行診斷;②患者術(shù)前未接受其他任何形式的治療;③所有患者均簽署知情同意書;④本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會許可，并監(jiān)督。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他腫瘤者;②心、肝和腎功能異常者;③存在感染或免疫功能缺陷者。

1.2材料

雙色位點特異性TERC/CSP3DNA探針購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司;20×SSC雜交緩沖液和胃蛋白酶K購自Sigma公司;封片劑購自碧云天生物科技有限公司;抗人hTERT小鼠單克隆抗體購自Santa公司;熒光原位雜交儀購自CVCytovisionAC.UNK;熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡均購自奧林巴斯公司;FISH分析軟件購自德國LEICA公司;羊抗小鼠二抗購自北京中山金橋生物有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1FISH分析

hTERC擴增制備石蠟組織芯片，并在載玻片上做好標(biāo)記，石蠟組織芯片56℃烘烤過夜，在二甲苯中脫蠟10min后，依次在100%、95%、70%的無水乙醇中水化5min，然后在蒸餾水中浸泡5min，并在水浴鍋沸水中處理30min修復(fù)抗原表位。緊接著在室溫條件下用2×SSC緩沖液漂洗組織芯片2次，每次5min;然后用胃蛋白酶K在37℃消化組織20min，結(jié)束后采用2×SSC緩沖液漂洗組織芯片2次，每次5min;用1%甲醛固定10min，再用70%、95%和100%的乙醇逐級脫水2min，56℃加熱玻片，結(jié)束后再組織玻片上滴加5～10μl探針混合物，蓋上蓋玻片，用中性樹脂封片。然后設(shè)置原位雜交儀，83℃變形5min，42℃雜交16h，結(jié)束后用2×SSC緩沖液漂洗組織芯片2次，每次5min;泡掉蓋玻片，置于65℃0.5%NP－40的2×SSC緩沖液漂洗組織芯片2次，每次5min;再用70%的乙醇浸泡3min，自然干燥玻片。然后再用DAPI染色細(xì)胞核3min，避光處理10min，然后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。觀察FISH結(jié)果，首先在低倍鏡下找到細(xì)胞區(qū)域，然后在40×物鏡下觀察標(biāo)本的治療，最后在100×物鏡下觀察宮頸細(xì)胞的FISH結(jié)果。顯微鏡下GLPTERC標(biāo)記為紅色，CSP3標(biāo)記為綠色。正常細(xì)胞可觀察到細(xì)胞分裂間期細(xì)胞核中紅色和綠色信號各有2個，而異常細(xì)胞可觀察到紅色信號大于2個，綠色信號不小于2個。

1.3.2閾值建立

以正常宮頸細(xì)胞建立組織細(xì)胞芯片，按照上述方法制備關(guān)于TERC基因的FISH實驗，然后分析100個細(xì)胞，統(tǒng)計TERC、C－myc基因異常擴增的細(xì)胞比例。閾值計算=平均數(shù)+3×標(biāo)準(zhǔn)差。若觀察組患者異常數(shù)目大于閾值則認(rèn)為是hTERC擴增呈陽性，若異常數(shù)目低于閾值則認(rèn)為是hTERC擴增呈陰性。

1.3.3Westernblot分析

hTERT表達(dá)水平取0.1g宮頸癌組織或正常宮頸組織，加入400μl組織裂解液，采用組織勻漿儀勻漿后，置于冰上靜置30min后，12000r/min離心15min，上清部分加入5×Load-ingbuffer，在沸水中煮沸15min后，進(jìn)行SDS－PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉30min后，用抗人hTERT小鼠單克隆抗體(1∶1000)4℃包被過夜，次日，用PBST洗滌3次，每次5min，再用HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗室溫孵育1h，結(jié)束后用PBST洗滌3次，每次5min;在PVDF膜上涂上發(fā)光液，在暗室進(jìn)行顯影。以GAPDH作為內(nèi)參。分析hTERT蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3.4隨防情況

觀察組患者術(shù)后第1年每3個月來我院檢查1次，第2年每半年檢查1次。電話隨訪患者生存情況，隨訪10～36個月，平均隨訪(21.4±8.9)個月。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)采用(x±s)表示，計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，累積復(fù)發(fā)率和累計生存率比較采用Kaplan－Meier和Log－Rank進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組宮頸組織hTERC擴增情況采用FISH分析hTERC擴增情況，對照組hTERC擴增5例，陽性率11.11%，觀察組hTERC擴增32例，陽性率為71.11%，觀察組患者宮頸癌組織中hTERC擴增陽性率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2兩組宮頸組織hTRET表達(dá)情況對兩組宮頸組織中hTERT蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行Westernblot分析，觀察組患者宮頸癌組織中hTERT蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組宮頸組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

2.3hTERC擴增與患者術(shù)后復(fù)發(fā)和生存的關(guān)系對觀察組hTERC擴增陽性和陰性患者進(jìn)行跟蹤隨訪，對其宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)和術(shù)后生存率進(jìn)行比較分析，hTERC擴增陽性患者術(shù)后1年、2年和3年的累積復(fù)發(fā)率分別為12.5%(4/32)，21.88%(7/32)和43.75%(14/32)，hTERC擴增陰性患者術(shù)后1年、2年和3年的累積復(fù)發(fā)率分別為7.69%(1/13)，15.38%(2/13)和15.38%(2/13)。hTERC擴增陽性患者術(shù)后累計復(fù)發(fā)率明顯高于陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2A。hTERC擴增陽性患者術(shù)后1年、2年和3年的累積生存率分別為84.38%(27/32)，65.63%(21/32)和46.88%(15/32)，hTERC擴增陰性患者術(shù)后1年、2年和3年的累積生存率分別為92.31%(12/13)，84.62%(11/13)和69.23%(9/13)。hTERC擴增陽性患者術(shù)后累計生存率明顯低于陰性患者(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3討論

全世界每年將近50萬宮頸癌新發(fā)病例，中國每年約有13.5萬新發(fā)病例，死亡率位居女性腫瘤第2位，嚴(yán)重威脅女性健康〔6〕。目前，臨床上用于診斷宮頸癌的手段較單一，存在缺陷〔7〕。端粒酶在許多腫瘤組織中活性異常，可能與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)〔8〕。端粒是真核細(xì)胞染色體上一點重復(fù)的基因序列，他的主要功能是維持染色體的穩(wěn)定性和完整性，避免其發(fā)生融合、降解或重組等變化。其隨著細(xì)胞分裂逐漸變短，減小到一定閾值細(xì)胞會自動衰老死亡〔5〕。當(dāng)端粒酶活性異?；钴S和人端粒酶RNA擴增異常時，可導(dǎo)致細(xì)胞一直處于分裂增殖狀態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞異常增生，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生〔9〕。目前，端粒酶在宮頸癌組織中的活性及表達(dá)情況是基礎(chǔ)臨床研究的熱點。本研究采用FISH技術(shù)和Westernblot分析對宮頸癌組織中hTERC擴增和hTERT蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在宮頸癌組織中hTERC擴增明顯增加，高于對照組;hTERT蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織，提示，宮頸癌組織中端粒處于異?；钴S的狀態(tài)，可能成為導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因之一，同時提示，通過檢測宮頸組織中端粒酶的活性可以作為宮頸癌分子診斷的主要方法。手術(shù)治療宮頸癌仍然會出現(xiàn)一部分復(fù)發(fā)，降低了患者術(shù)后生存期〔10〕。將hTERC擴增陽性和陰性患者進(jìn)行分析隨訪，發(fā)現(xiàn)hTERC擴增陽性患者術(shù)后累積復(fù)發(fā)率明顯高于陰性患者，術(shù)后累積生存率明顯低于陰性患者，提示，hTERC擴增情況可能與患者術(shù)后預(yù)后存在密切關(guān)系，可作為臨床宮頸癌術(shù)后預(yù)后診斷的一個輔助標(biāo)志。值得注意的是，本研究樣本數(shù)量較少，有望通過增加樣本數(shù)量進(jìn)一步探討hTERC擴增和預(yù)后的相關(guān)性。宮頸癌組織中hTERC擴增異常，且hTERT蛋白處于高表達(dá)狀態(tài)，參與了宮頸癌的發(fā)生，且hTERC的擴增與患者術(shù)后預(yù)后密切相關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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作者：吳衡慧 張菊新 單位：河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科