表觀遺傳學(xué)的定義精選(九篇)

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第1篇：表觀遺傳學(xué)的定義范文

【關(guān)鍵詞】同性戀；基因；表觀遺傳

【Abstract】The reasons of homosexuality are complex. With the development of science and technology， the reasons of homosexuality are increasingly clearly understood， which mainly involve in physiological factors and social psychological factors. This paper reviews the reasons of homosexuality， like genetic factor， biological factor， endocrine factor， Social psychological factors， as well as the recent research achievement of epigenetic factors.

【Key words】Homosexuality； Genetic； Epigenetic

【中圖分類號(hào)】C913.14【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

自同性戀產(chǎn)生以來人們就沒有停止對(duì)其成因的探究，隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，生物醫(yī)學(xué)和分子流行病學(xué)的不斷進(jìn)步，以及生理學(xué)和心理學(xué)的發(fā)展都對(duì)探究工作提供了更多的理論依據(jù)，人們對(duì)同性戀有了更清晰的認(rèn)識(shí)。男男者已成為我國(guó)艾滋病流行的三大高危人群之一，同時(shí)也是性病的高危人群。其形成原因是十分復(fù)雜的，涉及生物、遺傳、心理、社會(huì)文化等多重因素。本文就針對(duì)男性同性戀成因的研究進(jìn)行綜述。

同性戀又稱同，是人際間性取向的一種。性取向指?jìng)€(gè)體或群體的持續(xù)地指向何方。同性戀現(xiàn)象自古就有， 并一直存在， 在任何歷史時(shí)期，任何文化背景下，不管社會(huì)主流支持還是反對(duì)，它都在人類社會(huì)中保持相當(dāng)?shù)谋壤?。同性?（ homosexuality） 一詞最早是由一名德國(guó)醫(yī)生Benkert Kertbeny于1869年提出的。這個(gè)詞的意思是指對(duì)異性不能做出性反應(yīng)，卻被同性別的人所吸引[1，2]?！渡鼈惱韺W(xué)百科全書》對(duì)同性戀的描述為：同性戀者是一個(gè)有著持久、顯著、唯一的受同性性別吸引，對(duì)同性有性渴望和性反應(yīng)，尋求同性并從中得到性滿足的人。我國(guó)有學(xué)者將同性戀定義為：這種關(guān)系可存在于內(nèi)在的心理上或外在的行為之中，如果某個(gè)人一生或一生中大部分時(shí)間都和同性別的人建立心理或者行為上的這種關(guān)系，就可稱為同性戀者。男性同性戀或稱男男者（men who have sex with men，MSM）指性取向?yàn)槟行?，且生理性別為男性者。

近年來，對(duì)于男男者的形成有先天說（生物因素）和后天說（環(huán)境因素）兩種說法，前者稱為素質(zhì)性同性戀，后者稱為境遇性同性戀[3]。但更普遍認(rèn)為是由生物因素和環(huán)境因素共同決定的。其中生物因素的研究主要集中在與遺傳學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)及性激素水平的相關(guān)范疇。環(huán)境因素主要在社會(huì)因素和心理因素兩方面。最近，有學(xué)者還提出了同性戀的表觀遺傳學(xué)說，研究顯示表觀遺傳學(xué)可能是導(dǎo)致同性戀的一個(gè)關(guān)鍵因素，從而擴(kuò)大了同性戀成因的研究范圍。

加州大學(xué)圣巴巴拉分校進(jìn)化遺傳學(xué)家William Rice[4，5]認(rèn)為，同性戀會(huì)隨后代遺傳，這必然存在某種原因。研究估計(jì)有8%的人群是同性戀，且眾所周知同性戀在家族中流行。如果一對(duì)雙胞胎中有一人是同性戀者，另一個(gè)有20%的概率也是同性戀。

Mustanski等[6]利用10cm距離上的403個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記測(cè)定其基因型，分別計(jì)算母系的、父系的和聯(lián)合遺傳的最大可能連鎖值，發(fā)現(xiàn)了連鎖值最高的3個(gè)區(qū)域：7q36、8p12和母源的10q26。而另一項(xiàng)針對(duì)男同性戀全基因組掃描的分析也發(fā)現(xiàn)這3個(gè)區(qū)域與性取向的聯(lián)系，并且發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的可能與MSM行為發(fā)生相關(guān)的14q32區(qū)[7]。

Camperio-Ciani等[8]比較了男性同性戀者和異性戀者的家系，結(jié)果顯示同性戀者母系女性親屬的生育能力顯著偏高，平均多生育33%的子女，父系女性親屬卻沒有，提示人類性取向相關(guān)的遺傳因素有可能位于X染色體上，這些遺傳因素未被逐步消除的原因在于攜帶該基因的女性生育能力較強(qiáng)。此外，男性同性戀的母系親屬中同性戀數(shù)目多于父系親屬，而且男性同性戀者多不是長(zhǎng)子，有較多的哥哥或姐姐。其他幾位學(xué)者的研究也報(bào)道多項(xiàng)家族性研究均證實(shí)男性同性戀具有遺傳特征，且其相關(guān)影響因素可能位于X染色體上[9-11]。攜帶有同性戀基因的個(gè)體細(xì)胞，在適宜的條件下，易于發(fā)展成同性戀細(xì)胞。這就說明，同性戀的性取向有70% 是遺傳基因所產(chǎn)生的結(jié)果[12]。Hamer等[13]對(duì)114個(gè)家庭中男性同性戀者的舅舅和表兄弟的性取向進(jìn)行家系和連鎖分析，并通過DNA連鎖分析了兄弟均為同性戀的40個(gè)家庭的X染色體的基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)Xq28區(qū)域可能有決定性取向的基因。

“男性基因”SRY（性別決定基因）的發(fā)現(xiàn)也從另外一個(gè)角度佐證了男性同性戀和變性者的生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)。SRY基因在哺乳動(dòng)物性別決定中起關(guān)鍵作用，它是決定因子（ TDF），啟動(dòng)分化， 是發(fā)育負(fù)調(diào)節(jié)的抑制因子[13]。表現(xiàn)為XY的男性核型卻在性染色體中查不到SRY，或SRY發(fā)生了突變， 因此可能表現(xiàn)為女性化，即所謂“性反轉(zhuǎn)”[14]。迄今為止還沒有明確證據(jù)證實(shí)染色體上某一區(qū)域或基因與男性性取向相關(guān)，但似乎可以推測(cè)遺傳基因在性取向的決定上具有重要的作用，這還有待于進(jìn)一步的研究。

澳大利亞學(xué)者對(duì)112 名男性同性戀和258 名男性異性戀的基因進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)554%的男性同性戀的雄激素受體基因較長(zhǎng)，476%的男性異性戀雄激素受體基因較長(zhǎng)。研究人員說，雄激素受體基因較長(zhǎng)可能導(dǎo)致激素信號(hào)傳輸弱，而激素是決定早期發(fā)育過程中大腦性別認(rèn)知雄性化的關(guān)鍵因素。該研究認(rèn)為，激素水平較低可能導(dǎo)致男性在大腦發(fā)育期時(shí)雄性化的過程不完整，造成性別認(rèn)知方面傾向于女性[15]。

瑞典研究人員發(fā)現(xiàn)，男性同性戀者和女性異性戀者的大腦結(jié)構(gòu)上存在某些相似特點(diǎn)，他們對(duì)一些志愿者進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，腦部核磁共振成像顯示，女性同性戀者和男性異性戀者都擁有不對(duì)稱的大腦，左側(cè)腦半球比右側(cè)腦半球略小；而男性同性戀者和女性異性戀者的左右腦半球是對(duì)稱的。研究人員還應(yīng)用相關(guān)檢測(cè)設(shè)備對(duì)志愿者腦部杏仁核區(qū)域做了分析，結(jié)果顯示，男性同性戀者和女性異性戀者的杏仁核結(jié)構(gòu)存在著相似性，而男性異性戀者和女性同性戀者的杏仁核結(jié)構(gòu)更為相似。

科學(xué)家從腦和內(nèi)分泌的研究出發(fā)，認(rèn)為下丘腦是大腦負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)包括性活動(dòng)在內(nèi)的身體功能的器官，同性戀可能與下丘腦有關(guān)。發(fā)現(xiàn)同性戀男性的下丘腦前部神經(jīng)元的密度只是異性戀男性的一半，而下丘腦前角是大腦中能影響的部分，提出同性戀男性下丘腦前核神經(jīng)元解剖學(xué)的差異可能導(dǎo)致促性腺激素釋放激素釋放頻率的改變，這可能會(huì)成為性傾向起因的生物學(xué)基礎(chǔ)。另外，Levay等比較了同性戀男性和異性戀男性的4種下丘腦前部間質(zhì)核（interstitial nuclei of the anterior hypothalamus，INAH）的數(shù)量，其中INAHl-3是決定人類性別二態(tài)性的主要區(qū)域，結(jié)果顯示異性戀男性INAH-3的數(shù)量是男性同性戀者的兩倍。人體解剖發(fā)現(xiàn)男性同性戀INAH-3的體積與男性異性戀相比較小，但女性中卻未顯示出這種差異，提示了INAH-3與男性性取向的關(guān)系[16]。但目前尚未找到造成同性戀者大腦具有獨(dú)特性的原因，要深入了解與同性戀相關(guān)的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制需要進(jìn)行更大規(guī)模的研究。

一些研究者考慮到激素可能會(huì)導(dǎo)致同性戀。胎兒的大腦受何種性激素的影響，決定了個(gè)體細(xì)胞未來的性取向。如果男性胎兒未得到激素的影響，而是受到母親卵巢的雌激素影響，男性胎兒大腦就會(huì)女性化；女性胎兒如果受到激素的影響，女性胎兒大腦就會(huì)雄性化[13]。有學(xué)者推測(cè)異性性取向的男性的雄激素暴露水平在一個(gè)很小的范圍內(nèi)，不足或超過此范圍都可能增加男性成為同性戀的可能性 [17]。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)孕期暴露于乙醇與壓力應(yīng)激的聯(lián)合作用引發(fā)導(dǎo)致雄性后代的性取向的改變[18]。

一直以來也沒有任何的“同性戀基因”（gay genes）被確定。根據(jù)最新的一種假說，答案或許并不在于DNA本身，而是，隨著胚胎發(fā)育，子宮中母親和胎兒兩者生成的激素水平發(fā)生波動(dòng)，性相關(guān)基因?qū)Υ俗龀隽朔磻?yīng)性開啟和關(guān)閉。這樣的調(diào)節(jié)機(jī)制可使未出生的胎兒受益，即便是在激素處于頂峰時(shí)，也可以維持穩(wěn)定的雄性或雌性發(fā)育。然而如果到孩子出生或孩子擁有自己的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記時(shí)，這些所謂的表觀遺傳改變?nèi)匀淮媪?，那些后代其中的一些人就可能變成同性戀。在Rice[4，5]的研究中，顯示男性和女性胎兒對(duì)于它們周圍的激素反應(yīng)并不相同，甚至當(dāng)一種激素暫時(shí)性增高時(shí)，這種差異并非是基因的結(jié)構(gòu)，而是基因激活的程度，以及蛋白修飾的方式及程度，如DNA甲基化與剪切、多聚尾修飾等。如在睪酮對(duì)胎兒發(fā)揮作用的信號(hào)通路中，幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)的表觀遺傳改變有可能根據(jù)需要鈍化或增進(jìn)了激素的活性。研究中還提到，這些表觀遺傳學(xué)變化在父母處于早期發(fā)育時(shí)保護(hù)了他們，而早期對(duì)父母有利的表觀遺傳改變可解釋同性戀在進(jìn)化中遺留下來。Rice等[19]最近還建立并發(fā)表了針對(duì)同性戀發(fā)展的表觀模型，該模型是基于胚胎干細(xì)胞的XX與XY核型的表觀遺傳標(biāo)記。這些標(biāo)記提高了XY胎兒中睪酮的靈敏度，降低了XX胎兒睪酮的靈敏度，從而性發(fā)展得以進(jìn)行。該模型預(yù)測(cè)，這些表觀遺傳標(biāo)記的子集進(jìn)行了跨代遺傳，建立了同性戀的表型。Ngun TC等[20]綜合相關(guān)證據(jù)認(rèn)為性取向是生物學(xué)的基礎(chǔ)并且認(rèn)為涉及表觀遺傳學(xué)機(jī)制，最近的研究表明，性傾向在同卵雙胞胎中比在異卵雙胞胎中更為一致，因此認(rèn)為，男性的性傾向與基因組中的一些區(qū)域相關(guān)聯(lián)，該研究驚喜的發(fā)現(xiàn)性取向與表觀遺傳機(jī)制有著重要的聯(lián)系。值得一提的是，在一些先天性腎上腺增生的女性病例中，由于其子宮內(nèi)高水平的睪酮激素以至于其后代中非異性戀的比例高于哪些非先天性腎上腺增生的女性。同時(shí)動(dòng)物模型研究有力的證明，激素暴露的長(zhǎng)期效應(yīng)是由表觀遺傳機(jī)制介導(dǎo)的，該文章通過描述的假說框架得出結(jié)論，遺傳和表觀遺傳共同解釋了性取向的有關(guān)成因問題并愈發(fā)的接近事實(shí)，但有關(guān)性取向的研究還仍然面臨很多挑戰(zhàn)。

到目前還沒有有力的證據(jù)能說明同性戀是由于生理因素導(dǎo)致的，而對(duì)于同性戀的形成機(jī)制的第二方面，主要包括社會(huì)因素和心理因素，其中比較有影響力的觀點(diǎn)主要有精神分析學(xué)說和行為主義學(xué)說。

關(guān)于童年早期性心理發(fā)展，弗洛伊德認(rèn)為個(gè)體在幼兒時(shí)都具有兩性素質(zhì)及雙性戀特性，到底發(fā)展成同性戀還是異性戀是與個(gè)體在成長(zhǎng)中的個(gè)人經(jīng)歷有關(guān)的。他認(rèn)為在人的個(gè)體發(fā)展過程當(dāng)中，4 至6 歲是兒童性別認(rèn)同、性別角色發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期，在此期間兒童有著強(qiáng)烈的“戀父情結(jié)”或“戀母情結(jié)”，對(duì)異性的父母有著本能、強(qiáng)烈的依戀情感，而對(duì)同性別的父母則產(chǎn)生敵對(duì)情緒。父母如果在此期間對(duì)兒童的這種性本能不過分刺激也不過分抑制，兒童就會(huì)順利通過這一時(shí)期而隨后逐漸對(duì)同性父母認(rèn)同。反之，如果在此期間兒童遭受心理創(chuàng)傷，就可能隱藏在潛意識(shí)里，并且在青春期時(shí)表現(xiàn)出來，可能發(fā)展為同性戀[21]。家庭環(huán)境對(duì)MSM的影響很大，1962 年，貝博提出的“家庭動(dòng)力是同性戀主因”認(rèn)為同性戀根源于早期家庭經(jīng)驗(yàn)。他們大多數(shù)來自單親家庭，從小缺乏父母一方的關(guān)愛；或是父母關(guān)系很差，經(jīng)常爭(zhēng)吵，長(zhǎng)期分居兩地；還有的是個(gè)體所處的家庭結(jié)構(gòu)是由他/她和多個(gè)異性姐妹組成的，或者個(gè)體從小被父母當(dāng)女兒養(yǎng)，從小和女孩子一起玩，產(chǎn)生了性倒錯(cuò)[21，22]，將會(huì)導(dǎo)致個(gè)體對(duì)其性別的自我認(rèn)同產(chǎn)生影響， 并影響以后所形成的性取向。在家庭關(guān)系中，通常是母親的形象和影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大過父親，所以兒子在青春期后會(huì)尋找一個(gè)具有父親身上沒有的“男性力量”的人作為伴侶。

行為主義者認(rèn)為，同性戀由環(huán)境影響形成。一個(gè)人在青少年時(shí)期如果在與異往中受挫或有過不快的經(jīng)歷，異性情感沒得到正常的發(fā)展而與此同時(shí)又受到了同性方面的引誘，就可能產(chǎn)生同性戀傾向[23，24]，特別的，第一次性經(jīng)歷對(duì)個(gè)體性取向的影響很大，許多同性戀者第一次受人引誘或者在其他情況下發(fā)生同性，從而“欲罷不能”。有學(xué)者認(rèn)為同性戀的形成是極度壓抑的結(jié)果，如果一個(gè)人對(duì)性的需求無法通過正常的異性途徑獲得滿足，便會(huì)壓抑它，壓抑的結(jié)果便是性需求更大，而為了消除性需求所帶來的壓抑，個(gè)體就會(huì)另尋出路去放松這種壓抑，一旦個(gè)體以同性的方式緩解了壓力，就有可能經(jīng)過多次該行為的強(qiáng)化而形成同性戀。

學(xué)校是兒童接受教育的地方，同時(shí)也是孩子的主要活動(dòng)場(chǎng)所，孩子的大部分時(shí)間都要在學(xué)校這個(gè)微縮型社會(huì)環(huán)境中度過，尤其是初中和高中正值學(xué)生性心理迅速發(fā)展成熟的時(shí)期，其間發(fā)生的任何事情如學(xué)校和老師對(duì)學(xué)生的性教育方式和力度、關(guān)切程度，以及同伴之間的相互影響等都會(huì)給孩子造成很大的影響。

李玉玲等[25]提出同性戀發(fā)生的原因在于性情緒的作用，男女同性戀的發(fā)生原因是相同的，同性戀與異性戀發(fā)生的原因也是相同的，都是由于性情緒的作用。當(dāng)個(gè)體在中體驗(yàn)到喜歡、興奮、沖動(dòng)、渴望等積極情緒時(shí)，則將帶來這些體驗(yàn)的人當(dāng)戀對(duì)象。若此人為同性，則產(chǎn)生同性戀；反之則為異性戀。此外，戀母情結(jié)對(duì)同性戀者的情緒的產(chǎn)生也有重要作用，有研究表明，同性戀者的父母不鼓勵(lì)男孩表現(xiàn)出男性特征，有統(tǒng)治欲的母親不允許兒子對(duì)除她自己之外的異性產(chǎn)生興趣[26]，因此產(chǎn)生變得膽小，甚至產(chǎn)生恐懼、偏執(zhí)的心態(tài)，從而影響其未來性取向。

此外，從中醫(yī)的陰陽角度來看，人體內(nèi)陰陽互藏，陰陽轉(zhuǎn)化。若男子，陽火不生，或陽剛之氣受挫，眾陰聚合，則易變主動(dòng)為主靜。陽中陰氣愈聚，陰陽失調(diào)，則為男子中的女性。相對(duì)而言，男子中的女性，為陰，而男子為陽，陰陽的相吸作用，促使他們的自然吸引從而在一起，使得他們相互補(bǔ)足依靠，相互需要，從對(duì)方身上獲得快樂，實(shí)現(xiàn)陰陽的互根交感作用[27]。

社會(huì)學(xué)的研究個(gè)案表明，同性戀個(gè)體之間在成因上是不完全相同的，單純從一種理論出發(fā)分析他們的成因是不科學(xué)的。比如說素質(zhì)性的同性戀即絕對(duì)同性戀和境遇性同性戀的成因有可能不同。境遇性同性戀更多地受環(huán)境的影響，如單性性環(huán)境的軍隊(duì)、監(jiān)獄等，他們中有些人在改變了環(huán)境之后，又恢復(fù)到異性戀的狀態(tài)。

綜上所述，目前研究男性同性戀成因的領(lǐng)域主要包括社會(huì)學(xué)、心理學(xué)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)、哲學(xué)等多個(gè)不同的學(xué)科，男性同性戀成因十分復(fù)雜，主要涉及遺傳因素、表觀遺傳學(xué)、神經(jīng)生物因素、發(fā)育及內(nèi)分泌因素、社會(huì)及心理因素等諸多方面，彼此之間的因果關(guān)系不明，盡管相關(guān)方面研究均取得了一定的進(jìn)展，但尚待解決。探索男性同性戀形成原因的道路還很長(zhǎng)，但是意義重大。

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第2篇：表觀遺傳學(xué)的定義范文

【關(guān)鍵詞】 殺傷細(xì)胞抑制性受體 基因表達(dá)調(diào)控 DNA甲基 組蛋白乙?；?/p>

HLA半相合異基因造血干細(xì)胞移植具有廣泛的臨床應(yīng)用前景， 但伴隨的問題是移植物抗宿主病發(fā)生率高， 免疫重建緩慢， 感染機(jī)會(huì)增加， 如何克服這些問題是目前造血干細(xì)胞移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來一系列重要的臨床研究發(fā)現(xiàn)， 在去除T細(xì)胞的HLA半相合異基因造血干細(xì)胞移植中， 殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immnoglobulinlike receptor， KIR）表型不合（移植物抗宿主方向）是對(duì)預(yù)后有利的因素[1-4]。KIR基因家族是表達(dá)在人自然殺傷（nature killer， NK）細(xì)胞和部分T細(xì)胞表面的具有調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞表面分子家族， 它通過與靶細(xì)胞表面相應(yīng)的HLA I類分子結(jié)合， 傳導(dǎo)激活或抑制信號(hào)， 調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能[5]。KIR基因在NK細(xì)胞表面呈隨機(jī)性、 多樣性的表達(dá)模式， 由此形成了多種多樣的能夠特異性的識(shí)別、 清除異常細(xì)胞的NK細(xì)胞群[6]。因此， 只有了解KIR基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制， 才能進(jìn)一步明確NK細(xì)胞的生物學(xué)特性， 才能使人為調(diào)控NK細(xì)胞活性為臨床應(yīng)用成為可能。但是， 目前關(guān)于KIR的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在從表觀遺傳學(xué)的角度對(duì)KIR3DL1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。

1 材料和方法

1.1 材料 人NK細(xì)胞系NK92MI購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù); 5氮胞苷（5azacytidine， Aza）、 曲古抑菌素A（trichostatin A， TSA）、 肌醇、 巰基乙醇、 葉酸均購(gòu)自Sigma公司; 氫醌和亞硫酸氫鈉由上海生化試劑公司生產(chǎn); αMEM培養(yǎng)基、 TRIzol RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司; 馬血清、 胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司; DNA提取試劑盒（Wizard Genomic DNA Purification Kit）、 MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、 dNTPs、 oligo(dT)18、 pGEMT easy載體、 T4 DNA連接酶、 感受態(tài)大腸桿菌JM109均購(gòu)自Promega公司; Taq酶購(gòu)自TaKaRa公司; PCR產(chǎn)物回收試劑盒（QIAquick Gel Extraction Kit）購(gòu)自Qiagen公司; PCR引物合成及測(cè)序均由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NK92MI細(xì)胞用含2 mmol/L左旋谷氨酰胺、 1.5 g/L NaHCO3、 0.2 mmol/L肌醇、 0.1 mmol/L巰基乙醇、 0.02 mmol/L葉酸、 125 mL/L馬血清、 125 mL/L胎牛血清的αMEM培養(yǎng)基， 于37℃、 50 mL/L CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)、 傳代。

1.2.2 總RNA及DNA的提取 采用TRIzol RNA提取試劑盒按說明書步驟提取細(xì)胞總RNA， 采用Wizard Genomic DNA Purification Kit按說明書步驟提取細(xì)胞基因組DNA， 紫外分光光度計(jì)定量。

1.2.3 DNA的亞硫酸氫鹽修飾 參照文獻(xiàn)[7]的方法， 取1 μg經(jīng)1 mL注射器抽吸剪切后的基因組DNA， 加入去離子水稀釋至50 μL， 向其中加入3 mol/L NaOH 5 μL， 37℃孵育25 min使DNA解開雙鏈; 然后加入新鮮配制的10 mmol/L氫醌30 μL及3 mol/L亞硫酸氫鈉520 μL（其內(nèi)已加3 mol/L NaOH 370 μL）， 混勻后于50℃孵育16 h; 用QIAquick Gel Extraction Kit純化修飾后的DNA， 加入3 mol/L NaOH 5 μL， 37℃孵育20 min終止硫化修飾， 最后經(jīng)3倍體積的無水乙醇沉淀后溶于20 μL去離子水， 修飾后的DNA于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序檢測(cè)啟動(dòng)子甲基化狀態(tài) 按照完全修飾后的KIR3DL1基因DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物， 采用半巢式PCR擴(kuò)增KIR3DL1基因啟動(dòng)子。第1輪PCR反應(yīng)的上游引物: 5′GAAGAAGAGTTTGAATTTTAG3′， 下游引物: 5′CCATATCTTTACCTCCAAATC3′。以經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后的DNA為模板， 采用25μL的體系行PCR擴(kuò)增， 體系包含2.5μL 10×PCR緩沖液、 1.5 mmol/L MgCl2、 200 μmol/L dNTPs、 上下游引物各10 pmol/L和1.25 U Taq酶。擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性10 min， 然后95℃ 90 s， 48℃ 1 min， 72℃ 1 min， 共34個(gè)循環(huán)， 循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)于72℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20倍稀釋后取1 μL作為模板進(jìn)行第2輪擴(kuò)增， PCR條件同前，上 游引物: 5′GTTAGTATAGATTTTAGGTATTT3′， 下游引物序列同前， 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度397 bp。PCR產(chǎn)物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳， 將PCR產(chǎn)物切膠回收后用T4 DNA連接酶與pGEMT Easy載體相連，連接反應(yīng)體系: PCR產(chǎn)物與pGEMT Easy載體比例為3∶1， 2×連接反應(yīng)緩沖液 5 μL， T4 DNA連接酶1 μL， 用去離子水補(bǔ)至10 μL， 4℃孵育過夜。取5 μL連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109， 將PCR初步鑒定陽性的克隆送測(cè)序鑒定。

1.2.5 甲基化抑制劑和組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑處理NK92MI細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)前1 d將NK92MI細(xì)胞傳代， 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將細(xì)胞接種在 35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中， 每個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)， 用2 mL完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)孔加入終濃度依次為1 μmol/L、 2.5 μmol/L、 5 μmol/L的Aza， 或同時(shí)加入2.5 μmol/L的Aza和50 nmol/L的TSA， 或僅加入50 nmol/L的TSA， 對(duì)照孔加入等量PBS緩沖液， 細(xì)胞繼續(xù)置于37℃、 50 mL/L CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。每隔24 h更換新鮮培養(yǎng)液及相同濃度的藥物， 于處理72 h后收獲細(xì)胞， 檢測(cè)基因表達(dá)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 RTPCR檢測(cè)KIR3DL1基因表達(dá) 在20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中加3 μg RNA， 42℃水浴1 h， 95℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶后， 取1 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液為模板行PCR擴(kuò)增。根據(jù)文獻(xiàn)[8]合成引物， KIR3DL1上游引物: 5′ACATCGTGGTCACAGGTCC3′， 下游引物: 5′ACAACTTTGGATCTGGGCTT3′， 產(chǎn)物長(zhǎng)度為682 bp; 內(nèi)參照βactin上游引物: 5′CGCGAGAAGATGACCCAGATC3′， 下游引物: 5′TTGCTGATCCACATCTGCTGG3′， 產(chǎn)物長(zhǎng)度為734 bp。PCR體系同上。擴(kuò)增條件: 94℃預(yù)變性5 min后， 94℃ 1 min， 61℃ 1 min， 72℃ 45 s， 共5個(gè)循環(huán)， 然后94℃ 30 s， 60℃ 45 s， 72℃ 45 s， 共30個(gè)循環(huán)， 循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)于72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳， 紫外凝膠成像儀掃描分析， 以KIR3DL1/βactin光密度比值作為KIR3DL1 mRNA水平相對(duì)值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x±s表示， 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包行t檢驗(yàn)， 檢驗(yàn)水準(zhǔn)以P

2 結(jié)果

2.1 NK92MI細(xì)胞中KIR3DL1啟動(dòng)子區(qū)甲基化模式 CpG二核苷酸在KIR基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域密度增加， 其出現(xiàn)率（觀測(cè)值與期望值的比率）≥0.6， 符合CpG島的定義[9]， 因此， 本研究將KIR3DL1基因自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-270 bp至下游+69 bp之間的這段長(zhǎng)339 bp的序列定義為CpG島， 為便于分析說明， 將這段序列內(nèi)的全部19個(gè)CpG二核苷酸位點(diǎn)以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)編號(hào)， 上游為“-”， 下游為“+”。NK92MI細(xì)胞基因組DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后， 采用PCR擴(kuò)增KIR3DL1基因啟動(dòng)子序列， 將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌， PCR初步鑒定陽性重組子， 隨機(jī)挑取10個(gè)克隆行初步PCR鑒定， 均可擴(kuò)增出與預(yù)期大小相一致的目的片段（圖1）。陽性克隆進(jìn)一步測(cè)序， 結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中KIR3DL1基因啟動(dòng)子序列（基因號(hào)NM_013289）比對(duì)， 除第1、 4、 5號(hào)克隆序列錯(cuò)誤外， 得到7條正確的序列。亞硫酸氫鹽修飾可以使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶， 而甲基化的胞嘧啶保持不變， 以第10號(hào)克隆測(cè)序結(jié)果為例， 可見全部19個(gè)CpG二核苷酸位點(diǎn)由于被甲基化， CpG二核苷酸中的胞嘧啶保持不變， 其他部位的“C”全部發(fā)生改變（圖2）。綜合分析所得7條正確序列測(cè)序結(jié)果， NK92MI細(xì)胞中KIR3DL1基因啟動(dòng)子CpG二核苷酸位點(diǎn)甲基化頻率在70%～100%之間， 因此， KIR3DL1基因啟動(dòng)子處于高度甲基化狀態(tài)（圖3）。

圖1PCR方法鑒定含KIR3DL1啟動(dòng)子pGEMT easy載體的克隆（略）

Fig 1 Identification of clones containing KIR3DL1 promoterpGEMT easy vector by PCR amplification

M: DNA marker; 1-10: PCR products of clone 1 to 10.

圖2 經(jīng)硫化修飾后的KIR3DL1啟動(dòng)子部分測(cè)序結(jié)果（略）

Fig 2 Partial result of DNA sequencing of bisulfiteconverted KIR3DL1 promoter

圖3 NK92MI細(xì)胞系中KIR3DL1啟動(dòng)子各CpG位點(diǎn)的甲基化頻率（略）

Fig 3 Methylation frequency at inpidual CpG positions of KIR3DL1 promoter in NK92MI cell line

2.2 去甲基化誘導(dǎo)NK92MI細(xì)胞KIR3DL1表達(dá)增加 為進(jìn)一步分析KIR3DL1基因啟動(dòng)子甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系， 采用不同濃度的去甲基化藥物Aza處理NK92MI細(xì)胞， 結(jié)果顯示， 終濃度為1 μmol/L的Aza作用72 h， NK92MI細(xì)胞中KIR3DL1 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比無明顯增加（t=0.632， P=0.562）， 而2.5 μmol/L和5 μmol/L的Aza可以使KIR3DL1 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比分別增加66.6%和114.6%（統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果分別為: t=3.411， P=0.027; t=6.454， P=0.003）， 說明去甲基化藥物Aza可以誘導(dǎo)NK92MI細(xì)胞中KIR3DL1表達(dá)， 隨藥物濃度增加， 這一誘導(dǎo)作用逐漸增強(qiáng)（圖4A）; 單用50 nmol/L的TSA處理NK92MI細(xì)胞72 h， KIR3DL1 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.203， P=0.852）， 將50 nmol/L的TSA與2.5 μmol/L Aza聯(lián)用處理NK92MI細(xì)胞72 h， KIR3DL1 mRNA表達(dá)量與單用Aza組相比也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.840， P=0.140）， 說明單用TSA不能誘導(dǎo)KIR3DL1表達(dá)， 其與Aza聯(lián)用后也沒有協(xié)同作用（圖4B）。

圖4 RTPCR方法檢測(cè)經(jīng)5氮胞苷和曲古抑菌素A處理的NK92MI細(xì)胞中KIR3DL1 mRNA表達(dá)（略）

Fig 4 Detection of KIR3DL1 mRNA levels in 5azacytidine and trichostatin Atreated NK92MI cells by RTPCR

A: NK92MI cells were treated with different final concentrations of 5azacytidine (1 μmol/L， 2.5 μmol/L and 5 μmol/L) for 72 h; B: NK92MI cells were treated with 2.5 μmol/L of 5azacytidine and (or) 50 nmol/L of trichostatin A for 72 h. aP

3 討論

KIR基因家族位于人染色體19q13.4， 目前發(fā)現(xiàn)有17個(gè)成員。KIR基因家族的特點(diǎn)是各成員在NK細(xì)胞表面呈隨機(jī)性、 多樣性的表達(dá)， 每個(gè)NK細(xì)胞只表達(dá)KIR基因家族部分成員， 一種KIR分子的表達(dá)不依賴于其他KIR分子， 從而形成了表達(dá)多種多樣KIR分子的NK細(xì)胞群[5]。KIR基因的這一特有的表達(dá)模式對(duì)NK細(xì)胞特異性識(shí)別和清除異常細(xì)胞非常重要。在異基因造血干細(xì)胞移植中由于供受者之間KIR不相容引發(fā)的異源反應(yīng)性NK細(xì)胞活性有利于增強(qiáng)移植物抗白血病作用、 抑制移植物被排斥和移植物抗宿主病、 促進(jìn)造血干細(xì)胞植入， 延長(zhǎng)患者生存期， 因此， 明確KIR表達(dá)調(diào)控機(jī)制， 調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活性， 對(duì)改善造血干細(xì)胞移植預(yù)后具有重要臨床意義， KIR基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制已成為近年來的研究熱點(diǎn)[10]。KIR3DL1基因與KIR家族其他成員的5′側(cè)翼區(qū)序列同源性高達(dá)91.1%～99.6%， 在NK細(xì)胞表面呈多樣性表達(dá)[11]。本研究組的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)KIR3DL1基因啟動(dòng)子在沒有內(nèi)源性KIR3DL1基因表達(dá)的K562細(xì)胞中具有活性（結(jié)果未顯示）; Stewart等[12]的研究也證實(shí)， KIR3DL1基因啟動(dòng)子不僅在有KIR3DL1基因表達(dá)的NK細(xì)胞系YTIndy中有活性， 并且在沒有KIR3DL1基因表達(dá)的T細(xì)胞系Jurkat中也具有活性。可見KIR3DL1基因轉(zhuǎn)錄激活所需的反式作用因子在不同細(xì)胞系中廣泛分布， 提示表觀遺傳機(jī)制可能在調(diào)控KIR3DL1基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。為此， 本研究首先采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法對(duì)NK92MI細(xì)胞中KIR3DL1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)， 證實(shí)KIR3DL1基因啟動(dòng)子存在高甲基化， 然后用去甲基化藥物處理NK92MI細(xì)胞， 研究啟動(dòng)子甲基化與KIR3DL1基因表達(dá)的關(guān)系， 以確定KIR3DL1基因的表達(dá)是否受甲基化調(diào)控。

大量研究已證實(shí)DNA甲基化可以調(diào)控基因表達(dá)[13]， 啟動(dòng)子甲基化， 基因轉(zhuǎn)錄活性被抑制; 去甲基化， 這一抑制作用被取消。DNA甲基化介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制的機(jī)制可能包括以下三方面: 其一， DNA甲基化直接干擾特異轉(zhuǎn)錄因子與各自啟動(dòng)子的識(shí)別位點(diǎn)相結(jié)合， 抑制基因轉(zhuǎn)錄; 其二， 通過在甲基化DNA上結(jié)合特異的轉(zhuǎn)錄阻遏物（如甲基胞嘧啶結(jié)合蛋白1， 2）， 這種蛋白質(zhì)可以和轉(zhuǎn)錄因子競(jìng)爭(zhēng)性地與甲基化DNA的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合， 抑制基因轉(zhuǎn)錄; 其三， 甲基化改變了蛋白質(zhì)與DNA的相互作用， 導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，抑制基因轉(zhuǎn)錄。Aza是一種常用的甲基化抑制劑， 它通過與DNA甲基化酶共價(jià)結(jié)合， 降低其生物活性，從而逆轉(zhuǎn)DNA甲基化。本研究證實(shí)Aza能夠誘導(dǎo)NK92MI細(xì)胞KIR3DL1基因表達(dá)增加， 由此可以推斷KIR3DL1基因表達(dá)受啟動(dòng)子甲基化調(diào)控。

組蛋白乙?；潜碛^遺傳調(diào)控的另外一個(gè)重要方面[14]， 組蛋白乙?；梢阴；D(zhuǎn)移酶催化完成， 此時(shí)染色質(zhì)呈疏松狀態(tài)， 有利于基因的表達(dá); 相反， 組蛋白去乙?；扇ヒ阴；D(zhuǎn)移酶催化完成， 此時(shí)染色質(zhì)呈壓縮狀態(tài)， 不利于基因的表達(dá)。組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑TSA通過提高組蛋白乙?；?， 活化基因轉(zhuǎn)錄。但本研究應(yīng)用TSA處理NK92MI細(xì)胞， 未見KIR3DL1基因表達(dá)增加， 也沒有觀察到其與Aza的協(xié)同作用; 本研究的前期結(jié)果顯示， 即使用300 nmol/L的TSA也不能明顯增加KIR3DL1基因轉(zhuǎn)錄（結(jié)果未顯示）; Santourlidis等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)， 用25 nmol/L的TSA處理NKL細(xì)胞系不能誘導(dǎo)KIR3DL1基因轉(zhuǎn)錄增加。由此推測(cè)組蛋白乙?；赡茉贙IR3DL1基因表達(dá)調(diào)控中作用不大。

綜上所述， 通過檢測(cè)NK92MI細(xì)胞KIR3DL1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化模式， 證實(shí)NK92MI細(xì)胞中KIR3DL1基因啟動(dòng)子存在高甲基化， 去甲基化處理能夠誘導(dǎo)NK92MI細(xì)胞表達(dá)KIR3DL1基因， 因此， NK92MI細(xì)胞中KIR3DL1基因表達(dá)受啟動(dòng)子甲基化調(diào)控。

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