白芷質(zhì)量控制按對照提取物定量研究

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摘要:目的評(píng)價(jià)用對照提取物定性和一測多評(píng)定量相結(jié)合的方法對白芷藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。方法用高效液相色譜法，色譜柱:ACEUltraCoreC18(50mm×2.1mm，2.5μm)，流動(dòng)相:乙腈－水梯度洗脫，流速:0.5mL•min－1，柱溫:30℃，檢測波長:310nm，進(jìn)樣量:5μL。考察該方法的專屬性、標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限、精密度與回收率、穩(wěn)定性以及重現(xiàn)性。結(jié)果高效液相色譜法對白芷中的5種主要香豆素類成分，佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、cinidilin和異歐前胡素進(jìn)行了快速分離，線性關(guān)系良好(r≥0.9994)，回收率較高，均在96.4%～100.0%內(nèi)。對照提取物能快速對白芷中的5種主要成分進(jìn)行定性。單標(biāo)定量方法測得成分含量與標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的結(jié)果一致。結(jié)論對照提取物定性和單標(biāo)定量相結(jié)合的質(zhì)量控制方法是簡單、可行的，能有效地對白芷藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞:白芷;質(zhì)量控制;對照提取物;單標(biāo)定量

白芷為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根，其主要活性成分為香豆素類化合物［1］。白芷作為中國傳統(tǒng)中藥，在河北省均有廣泛種植與分布，為河北省道地中藥材。然而由于不同的加工工藝以及不同的來源，市售的白芷質(zhì)量存在一定的差異，為了保證用藥的安全有效，本研究將對照提取物鑒定和一測多評(píng)定量方法有機(jī)結(jié)合，建立中藥質(zhì)控的方法，并將其應(yīng)用于河北道地藥材白芷的質(zhì)量控制研究，為中藥對照品缺乏下的中藥質(zhì)量控制提供現(xiàn)實(shí)可行的方案。

材料和方法

1儀器與試藥

佛手柑內(nèi)酯對照品，規(guī)格:每瓶20mg，批號(hào):07111221，上海同田生物技術(shù)有限公司提供;歐前胡素、異歐前胡素、cinidilin和氧化前胡素，河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院自制，經(jīng)HPLC－DAD分析純度不少于98%;白芷樣品1～6(自然晾干的切片)，采自河北安國;白芷樣品7～10(硫熏樣品)，購自河北石家莊當(dāng)?shù)厮幍?。?biāo)準(zhǔn)白芷香豆素提取物由白芷總提取物經(jīng)大孔樹脂分離和硅膠柱分離所得。包含了主要的5種香豆素成分:佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、cinidilin和異歐前胡素，其色譜峰面積比例為0.2∶1.9∶1.0∶0.7∶0.8，與其在原藥材中的比例相似。1200高效液相色譜儀，美國Agilent公司產(chǎn)品。

2色譜條件

色譜柱:ACEUltraCoreC18(50mm×2.1mm，2.5μm);流速:0.5mL•min－1;柱溫:30℃;檢測波長:310nm;流動(dòng)相:乙腈－水梯度洗脫;進(jìn)樣量:5μL。梯度洗脫程序?yàn)?～5min，45%～45%乙腈;5～15min，45%～80%乙腈。

3溶液的制備

對照品溶液制備分別稱取佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、cinidilin和異歐前胡素對照品適量，用75%甲醇溶解、稀釋配制成質(zhì)量濃度為1.0mg•mL－1對照品溶液。供試品溶液制備白芷藥材粉碎，過3號(hào)篩，稱取0.5g，置于50mL量瓶中，加入75%甲醇20mL，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲提取30min，取出，放冷，用75%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，取上清液過0.45μm微孔濾膜，即得。

4方法學(xué)考察

專屬性分別吸取對照品溶液和供試品溶液5μL，用上述色譜條件進(jìn)行分析，考察待測組分與樣品中其他物質(zhì)的分離情況。標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限吸取對照品儲(chǔ)備液適量，稀釋成系列濃度，進(jìn)樣并測定峰面積，以對照品溶液的濃度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。各分析化合物根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量(Method1)。將合適量的對照提取物溶解于75%甲醇中，配制成系列濃度的溶液，按上述方法對其中的主要成分歐前胡素進(jìn)行線性回歸，用得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對5種香豆素類成分進(jìn)行定量計(jì)算(Method2)。將混合對照品溶液逐步稀釋并進(jìn)行測定，以信噪比S/N≥3時(shí)確定為檢測限，以信噪比S/N≥10時(shí)確定為定量限。精密度與回收率配制低、中、高3種不同的濃度，日內(nèi)精密度是在同一天內(nèi)對同一份樣品連續(xù)測定6次，日間精密度則是在連續(xù)3d內(nèi)對同一份樣品進(jìn)行測定，通過計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來實(shí)現(xiàn)。取含量已知的白芷樣品0.25g，分別加入一定濃度的對照品溶液，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣，測定樣品溶液中有效成分的含量并計(jì)算平均回收率。穩(wěn)定性取白芷藥材粉碎，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，24h取供試品溶液進(jìn)樣測定峰面積。同時(shí)考察對照提取物溶液放置24h的穩(wěn)定性。

結(jié)果

1方法學(xué)評(píng)價(jià)

專屬性在上述色譜條件下，待測成分各色譜峰與其他成分分離良好，其他成分不干擾待測成分的測定。典型色譜圖見圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限5種成分的線性關(guān)系方程和線性范圍見表1，相關(guān)系數(shù)r≥0.9994，表明在線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。精密度與回收率5個(gè)分析物的日內(nèi)、日間變異分別小于1.3%和2.3%，回收率均大于96.4%，重復(fù)性良好(RSD≤1.3%)。結(jié)果見表2。穩(wěn)定性樣品及對照提取物在室溫下放置24h是穩(wěn)定的。結(jié)果見表2。

2方法學(xué)應(yīng)用

按“供試品溶液制備”方法制備10個(gè)批次白芷供品溶液，按色譜條件進(jìn)樣分析，測定5個(gè)成分的峰面積值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單標(biāo)定量法對白芷樣品中的5種測定成分含量進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果見表3。為了評(píng)價(jià)單標(biāo)定量的可行性(以歐前胡素為內(nèi)參，對其余4種成分進(jìn)行定量估算)，用不同百分?jǐn)?shù)(PD)和向量余弦相似度［Cos()］對兩種方法得計(jì)算結(jié)果進(jìn)行了評(píng)估。PD%=100×|X－Y|X+Y2，Cos()=∑ni=1XiYi∑ni(Xi)2∑ni(Yi)槡2其中，X，Y分別代表由標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單標(biāo)定量法計(jì)算所得成分含量，n代表樣品個(gè)數(shù)?？芍?，5種成分的平均PD均小于5%，兩種方法計(jì)算所得濃度具有一定的一致性。所有測定向量得Cos()＞0.9999，表明兩種方法具有較高的相似度。

討論

藥典規(guī)定白芷含量測定的質(zhì)量控制成分為歐前胡素，且該成分在白芷中含量較高，對照品易得，故選擇歐前胡素為內(nèi)參物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用單標(biāo)定量法所測得白芷中5種香豆素類成分含量與標(biāo)準(zhǔn)曲線法所測得的含量無明顯差異，說明在缺少對照品的情況下可以通過測定白芷中一種香豆素的含量來計(jì)算其他4種同類成分含量，進(jìn)而更全面地評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)一測多評(píng)。樣品測定結(jié)果表明，河北道地白芷藥材中氧化前胡素含量最高，5種主要香豆素類活性成分含量基本符合氧化前胡素﹥歐前胡素﹥異歐前胡素﹥cinidilin﹥佛手柑內(nèi)酯的順序。熏硫后(樣品7－10)多種香豆素類成分的含量有較大損失，此前也有文獻(xiàn)報(bào)道此類現(xiàn)象［2－3］，可見熏硫是白芷樣中香豆素類成分含量下降的主要因素。中藥成分復(fù)雜，多成分、多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式得到越來越多的認(rèn)可和應(yīng)用。然而，多指標(biāo)定量的中藥質(zhì)量控制模式需要足夠量的具有足夠高純度的對照品，這已成為制約中藥質(zhì)量控制的一個(gè)瓶頸。《中國藥典》2010年版提出一測多評(píng)的分析方法［4－5］，該方法實(shí)現(xiàn)了中藥多成分定量，解決了中藥化學(xué)對照品匱乏的瓶頸問題。然而，一測多評(píng)在實(shí)際應(yīng)用于定量測定時(shí)，由于只有內(nèi)參物用到了對照品，其他待測成分無對照品，無法準(zhǔn)確地確定待測組分峰(即目標(biāo)峰)的位置。針對此問題，《中國藥典》2005年版引入了對照提取物，將其作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)收載。對照提取物不但具有相對固定的定的化學(xué)組成，含有定量指標(biāo)的主要效應(yīng)成分，與原藥材量化關(guān)系明確，專屬性強(qiáng)，而且具有安全、穩(wěn)定的理化特性，尤其適用于中藥的鑒別。對照提取物鑒定和一測多評(píng)定量相結(jié)合將有助于更加有效地對藥材質(zhì)量進(jìn)行控制。

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作者：李德強(qiáng) 段立廣 鄭旭光 戴榮源 張志清 單位：河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部  河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 藥劑科 石家莊中國臨床藥理學(xué) 雜 志