SERS生物醫(yī)學(xué)論文
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1表面增強(qiáng)拉曼的原理
1.1sers閃爍和擺動(dòng)
有文獻(xiàn)報(bào)道在單顆粒和納米聚集體上發(fā)現(xiàn)了不連續(xù)表面增強(qiáng)拉曼散射現(xiàn)象。典型的閃爍時(shí)間間隔從毫秒到秒不等。最近的研究發(fā)現(xiàn)SERS閃爍包括了熱激活和光誘導(dǎo)兩個(gè)部分。許多證據(jù)顯示這種SERS信號(hào)的波動(dòng)是由于熱激活分子在顆粒表面的擴(kuò)散而產(chǎn)生的。利用波長(zhǎng)分辨光譜進(jìn)而發(fā)現(xiàn)信號(hào)波動(dòng)來(lái)自增強(qiáng)拉曼散射，而不是光致發(fā)光或者瑞利散射。測(cè)量的信號(hào)強(qiáng)度包含了拉曼和背景信號(hào)在557–663nm的波段的總和。另一個(gè)重要的特征是SERS光譜包含了很強(qiáng)的背景信號(hào)。這種背景信號(hào)并不是R6G的熒光而是SERS的連續(xù)發(fā)射信號(hào)。在SERS閃爍的“Off”階段，光數(shù)量很少，這說(shuō)明SERS信號(hào)和背景信號(hào)是成正相關(guān)的，而且是同時(shí)波動(dòng)的。Michaels等發(fā)現(xiàn)SERS強(qiáng)度和背景信號(hào)隨時(shí)間成高度相關(guān)。大量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在0.1mW激光激發(fā)下，SERS閃爍的On-time大約是80ms。另一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是SERS光譜擺動(dòng)現(xiàn)象，就是SERS信號(hào)會(huì)突然改變他們的頻率。這種現(xiàn)象首先由Nie和Emory報(bào)道。他們發(fā)現(xiàn)拉曼信號(hào)的頻率變化可以有10cm-1的改變。SERS光譜波動(dòng)的另一個(gè)來(lái)源是含碳基團(tuán)和其他光解化合物。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要把單分子SERS信號(hào)與污染分子的信號(hào)區(qū)分開(kāi)來(lái)。有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的氧氣在SERS閃爍中扮演了重要的角色。在含氧環(huán)境中SERS閃爍的頻率很快，波動(dòng)的幅度更大。其它的理論和實(shí)驗(yàn)則認(rèn)為SERS閃爍來(lái)自于顆粒本身而不是吸附分子的擴(kuò)散，因?yàn)樵跓o(wú)吸附物的條件下如銀粉和氣相沉積銀膜，同樣觀察到了閃爍現(xiàn)象。
1.2SERS活性位點(diǎn)
一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是關(guān)于顆粒表面的活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。之前的研究發(fā)現(xiàn)SERS活性位點(diǎn)很可能是吸附原子、原子簇和顆粒尖端。這些位置可以通過(guò)共振電荷轉(zhuǎn)移和類似共振拉曼增強(qiáng)方式進(jìn)行化學(xué)增強(qiáng)。換句話說(shuō)，吸附分子和活性位點(diǎn)之間的耦合可以產(chǎn)生新的金屬配體或者配體金屬之間的電荷轉(zhuǎn)移，這種狀態(tài)可以用可見(jiàn)光激發(fā)。Hildebrandt等認(rèn)為SERS活性位點(diǎn)是高親和性結(jié)合位點(diǎn)。為了進(jìn)一步研究這些SERS活性位點(diǎn)，Doering等使用了一種整合流動(dòng)注射和光譜裝置來(lái)研究吸附分子被其他分子置換現(xiàn)象。在加入鹵化物之前，SERS光譜經(jīng)常包含很寬的背景和檸檬酸根的微弱信號(hào)，但是沒(méi)有R6G的信號(hào)。在加入鹵化物之后，他們發(fā)現(xiàn)R6G的SERS光譜很快替換了檸檬酸根的光譜，R6G的信號(hào)在10-30min中不斷增加。這種置換行為是連續(xù)的，最終SERS光譜被一種或吸附在活性位點(diǎn)的少量分子信號(hào)主導(dǎo)。這些結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明，這些SERS活性位點(diǎn)最開(kāi)始是沒(méi)有活性的或者被檸檬酸根離子所占據(jù)。鹵離子在顆粒表面的吸附可以幫助R6G在顆粒表面的吸附，并且阻礙檸檬酸根離子在活性位點(diǎn)的吸附。
1.3化學(xué)激活和失活
研究SERS機(jī)制時(shí)面臨的一個(gè)重要困難是將化學(xué)增強(qiáng)因素從電磁效應(yīng)中分離出來(lái)。為了解決這一問(wèn)題，Doering等使用了整合流動(dòng)注射和超靈敏光學(xué)成像系統(tǒng)直接研究化學(xué)增強(qiáng)。他們的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中膠體銀顆粒被固定在微流動(dòng)裝置的玻璃表面，在固定顆粒表面加入化學(xué)試劑就可以實(shí)時(shí)觀察到單顆粒SERS信號(hào)。這種單顆粒原位表面等離子體散射研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過(guò)化學(xué)處理后，單顆粒的電磁性質(zhì)并未改變。因此觀察到的SERS光譜變化應(yīng)該主要來(lái)自于化學(xué)增強(qiáng)。他們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明3種鹵粒子(Cl、Br和I)有顯著的SERS激活效應(yīng)，而其他離子，如檸檬酸根、硫酸根和氟化物則對(duì)單顆粒SERS信號(hào)幾乎無(wú)影響。然而，他們發(fā)現(xiàn)硫代硫酸根離子則會(huì)使SERS信號(hào)完全消失。在對(duì)顆粒處理鹵粒子和硫代硫酸根處理25min后，未產(chǎn)生任何表面等離子體散射的變化。因?yàn)楸砻娴入x子體散射可以用于測(cè)量單個(gè)和多個(gè)顆粒的電磁場(chǎng)性質(zhì)，因而他們認(rèn)為這種觀察到的激活/失活效應(yīng)主要來(lái)自于顆粒表面的原子尺度的改變，而不是大尺度的顆粒電磁場(chǎng)性質(zhì)改變。進(jìn)一步的波長(zhǎng)分辨實(shí)驗(yàn)表明，單顆粒等離子體散射可以引起散射光譜小的改變，但是這種小的位移不太可能引起電磁增強(qiáng)發(fā)生大的變化。事實(shí)上，之前的研究顯示表面等離子體光譜通常很寬，而單分子SERS與表面等離子體散射并不直接相關(guān)。
1.4單顆粒和多顆粒的SERS比較
為了比較單個(gè)顆粒和小聚集體之間的SERS活性，Khan等核實(shí)了SERS活性位點(diǎn)是否跟表面缺陷或者顆粒間隙有相關(guān)性。不過(guò)結(jié)果顯示，高SERS活性跟表面性質(zhì)沒(méi)有顯著相關(guān)性。另外，他們也發(fā)現(xiàn)有些固定的單顆粒與Dimers和Trimers的平均SERS強(qiáng)度相似，但這些信號(hào)強(qiáng)度比那些大聚集體的信號(hào)低3-4倍。但是單顆粒的SERS信號(hào)重復(fù)性更好，而且具有更窄的光閃爍時(shí)間間隔。盡管理論預(yù)測(cè)單個(gè)納米顆粒周圍的電磁場(chǎng)強(qiáng)度沒(méi)有兩個(gè)顆粒之間的Nano-gap的強(qiáng)，但每個(gè)顆?？梢晕酱罅康姆肿?。當(dāng)單個(gè)顆粒表面吸附了單層拉曼分子時(shí)，其SERS信號(hào)就達(dá)到最大值。當(dāng)分子定位在兩個(gè)靠近的納米金納米縫隙中時(shí)，可以使SERS信號(hào)得到極大增強(qiáng)。然而，事實(shí)上，很難制造出這種Dimer或Trimer，可以讓分析物非常精確地定位在Nano-gap里。并且，金屬納米顆粒是被周圍的電子云包圍，他們可以通過(guò)靜電排斥阻止其他顆粒靠近。這種靜電排斥可以被強(qiáng)電解質(zhì)減弱，但這樣經(jīng)常會(huì)引起不可控的顆粒聚集和沉淀。一個(gè)可行的辦法是加入高分子或表面活性劑提供空間位阻，因而阻止納米金的直接接觸。Chen等制備了Au@Ag的Dimer和Trimer結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)dimer的SERS效果是單顆粒的16倍，而trimer是單顆粒的87倍。Lee近一步研究了Dimer之間的距離跟SERS效應(yīng)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Dimer之間的gap達(dá)到1nm以下時(shí)，增強(qiáng)因子可以達(dá)到1013。
2表面增強(qiáng)拉曼探針的制備
納米技術(shù)的發(fā)展給SERS技術(shù)的發(fā)展帶來(lái)了新的活力。第一代SERS探針是由Porter等制備，他們使用拉曼分子和定位配體在金屬納米顆粒上共吸附的方式。然而，這種方式的一個(gè)很大局限性就是這些納米探針由于沒(méi)有跟外界的環(huán)境隔絕，容易發(fā)生光譜變化和膠體聚集。為了解決這個(gè)問(wèn)題，許多實(shí)驗(yàn)室使用了各種各樣的包裹策略。聚二乙烯基包裹的SERS探針可以很好的保護(hù)探針，但對(duì)于生物偶聯(lián)需要二次修飾，并且這種微米級(jí)的尺寸不太適合做細(xì)胞內(nèi)的分子檢測(cè)。二氧化硅修飾的探針是在納米級(jí)的，也適合生物分子共組裝。這種核-殼結(jié)構(gòu)的SERS探針包含了3種關(guān)鍵組分：金屬核心用于光學(xué)增強(qiáng)，報(bào)告分子用于光譜分析，二氧化硅殼用于保護(hù)和生物偶聯(lián)。這種設(shè)計(jì)成為SERS探針生物分析應(yīng)用的基礎(chǔ)模式，并可免受外界環(huán)境的干擾。完整的二氧化硅包裹可以增強(qiáng)SERS探針在高電解質(zhì)下的穩(wěn)定性。但是一個(gè)缺點(diǎn)就是這種二氧化硅包裹的顆粒容易非特異吸附蛋白和細(xì)胞表面。二氧化硅包裹技術(shù)需要拉曼分子帶有巰基或者異硫氰酸酯用于表面吸附。Qian等設(shè)計(jì)了一種新的SERS探針可以解決以上面臨的問(wèn)題。PEG修飾的SERS探針由3個(gè)組分組成：60nm的檸檬酸保護(hù)的納米金，拉曼分子和PEG-SH(5000MW)（圖5）。UV-Vis吸收，TEM，DSL測(cè)量顯示在納米金溶液中加入MGITC后沒(méi)有明顯的聚集。加入少量的MGITC沒(méi)有改變納米金在533nm的等離子體共振峰，但假如SH-PEG后有1nm的紅移。PEG-SH保護(hù)的納米金顆粒具有很小的非特異性吸附和可忽略的細(xì)胞毒性。另外，使用不同修飾的PEG可以偶聯(lián)多種生物配體分子。PEG-SH修飾納米金顆?？梢允褂梅菐€基拉曼分子結(jié)合在納米金上，同時(shí)卻可以阻止溶液里的其他分子接近納米金表面。與二氧化硅包裹不同的是。PEG-SH包裹并不會(huì)將吸附的非巰基拉曼分子置換掉。根據(jù)對(duì)多種拉曼分子如CrystalViolet、NileBlue、BasicFuchsin和CrysylViolet關(guān)于Perchlorate的研究顯示，這些非巰基的染料跟PEG-SH可以很好的兼容。事實(shí)上，使用CrystalViolet的SERS探針可以穩(wěn)定超過(guò)11個(gè)月。研究中使用的染料都是帶正電荷的，并包含多個(gè)π鍵。這說(shuō)明很多種類的有機(jī)分子可以作為拉曼分子用于PEG-SH包裹的SERS探針。為了將SERS探針用于多元檢測(cè)和成像，需要篩選出不同的拉曼分子，由于拉曼分子拉曼峰有時(shí)會(huì)重疊，對(duì)多元檢測(cè)造成困難。Wang合成了一種有機(jī)物-納米金-量子點(diǎn)的復(fù)合納米SERS探針，這種探針可以進(jìn)行SERS和熒光的雙重生物標(biāo)記，進(jìn)而可以用于生物標(biāo)記物的生物條形碼分析，增強(qiáng)了多元檢測(cè)能力。
3表面增強(qiáng)拉曼在生物分析中的應(yīng)用
在過(guò)去的十幾年中，研究者在SERS用于超靈敏檢測(cè)生物分子方面投入了極大的興趣，如血紅蛋白、葡萄糖、腫瘤基因、病原體、生物毒素和病毒檢測(cè)。SERS是一種近場(chǎng)探針，對(duì)周圍的環(huán)境很敏感。幾個(gè)研究小組的成果表明如果在金屬納米顆粒或者核殼結(jié)構(gòu)的顆粒表面修飾上pH敏感的SERS探針?lè)肿?，SERS可以作為一種pH納米探針用于細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外檢測(cè)。總體來(lái)說(shuō)，在SERS應(yīng)用方面現(xiàn)在有兩種類型的工作：第一種類型是使用單分子SERS用于單一分析物如DNA堿基對(duì)和單個(gè)血紅蛋白的指紋圖譜分析，這里，待分析分子被放置在單個(gè)顆粒的Hotspot位置或者是納米顆粒的聚集處；第二種類型是從納米顆粒表面覆蓋的單層分子上獲得的SERS圖譜，這種圖譜可以得到明確頻率和帶寬的宏觀數(shù)據(jù)。如果膠體納米粒子和分析物不受外界環(huán)境的影響，那么得到的SERS圖譜強(qiáng)度和重復(fù)性都是可控的。這種設(shè)計(jì)在復(fù)雜的細(xì)胞樣品或者全血分析中有強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。
3.1生物標(biāo)記物檢測(cè)
Jin等以多種拉曼分子修飾的納米金為SERS探針設(shè)計(jì)了一種多元SERS檢測(cè)平臺(tái)。每種SERS探針對(duì)應(yīng)一種DNA檢測(cè)分子，并使用銀沉積增強(qiáng)SERS信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了多種DNA分子的同時(shí)檢測(cè)。Kang等設(shè)計(jì)了一種Particle-on-wire的SERS傳感器用于DNA的多元檢測(cè)。在納米線與納米顆粒之間形成的Nanogaps里Hotspots可以顯著增強(qiáng)SERS活性，實(shí)現(xiàn)了多種病毒DNA分子的檢測(cè)。Souza等最近的工作使用了SERS探針實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)特定生物分子的定位檢測(cè)。他們使用Au-噬菌體-咪唑復(fù)合物用于標(biāo)記溶液里的細(xì)胞。但是噬菌體本身有很高的SERS背景信號(hào)，降低了實(shí)驗(yàn)的信噪比，而且探針光譜容易發(fā)生變化。Huang等證明了抗體標(biāo)記的金納米棒作為癌細(xì)胞診斷探針，這種探針使用CTAB作為SERS的拉曼分子。他們將金納米棒修飾上聚苯乙烯磺酸鈉來(lái)穩(wěn)定溶膠體系，將納米棒的表面電荷從負(fù)電荷變成正電荷。Hu等將氰基團(tuán)偶聯(lián)在拉曼分子上以此來(lái)區(qū)分其他分子的振動(dòng)峰。Yu等將納米銀結(jié)合上熒光染料，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和組織的SERS和熒光的雙重成像。
3.2單細(xì)胞分子成像
偶聯(lián)生物分子的SERS納米探針已經(jīng)用于識(shí)別腫瘤細(xì)胞上的蛋白標(biāo)記物。對(duì)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)來(lái)說(shuō)，可使用SH-PEG（~85%）和SH-PEG-COOH（~15%）的混合物來(lái)制備可定位納米金顆粒。雙修飾的PEG可以共價(jià)結(jié)合ScFv抗體上，ScFv抗體可以與表皮生長(zhǎng)因子特異性結(jié)合。人頭部和頸部腫瘤細(xì)胞(Tu686)都是EGFR陽(yáng)性的（每個(gè)細(xì)胞有個(gè)受體），可以用SERS方法檢測(cè)到。相反，人非小細(xì)胞肺癌則不表達(dá)EGF受體，不能顯示出SERS信號(hào)。人們使用一種近紅外染料(DTTC)用作光譜探針用于785nm的表面增強(qiáng)共振拉曼。這種共振增強(qiáng)不會(huì)引起光漂白，因?yàn)檫@種吸附染料將有效能量轉(zhuǎn)移到金屬顆粒而免于光降解。這種共振效應(yīng)可進(jìn)一步將SERS效果提高10–100倍。這種靈敏度足夠用于單個(gè)癌細(xì)胞的拉曼分析。EGFR是EGF抗體的特異靶標(biāo)，也是蛋白激酶療法的重要蛋白，因此單細(xì)胞SERS分析檢測(cè)EGFR對(duì)臨床診斷有重要意義。
3.3體內(nèi)腫瘤定位和檢測(cè)
為了確定在動(dòng)物組織中能否從PEG修飾的納米金顆粒上得到SERS圖譜，Qian等在活體動(dòng)物皮下組織和深層肌肉組織注入小量的SERS探針。結(jié)果表明可以同時(shí)在皮下組織和深層肌肉組織得到高度可辯SERS信號(hào)。盡管由體內(nèi)得到的信號(hào)強(qiáng)度減少了1-2個(gè)數(shù)量級(jí)，但得到的SERS圖譜與體外的圖譜一致。由于實(shí)驗(yàn)的信噪比很高，可以估算對(duì)于體內(nèi)SERS腫瘤檢測(cè)可以探測(cè)的深度是1-2cm。為了實(shí)現(xiàn)體內(nèi)腫瘤定位和成像，偶聯(lián)了ScFv抗體的納米金顆粒通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)入腫瘤小鼠體內(nèi)。使用785nm的激光照射了腫瘤和非腫瘤部位。可以看出在腫瘤部位可定位SERS探針與非可定位SERS探針的SERS圖譜有明顯的差距，然而對(duì)于非腫瘤區(qū)的SERS信號(hào)則很相似。結(jié)果說(shuō)明了ScFv抗體偶聯(lián)的納米金顆?？梢远ㄎ籈GFR陽(yáng)性的腫瘤組織中。時(shí)間分辨的SERS數(shù)據(jù)近一步表明了SERS探針在進(jìn)入小鼠體內(nèi)4-6h是逐漸積累的，并且大多數(shù)的探針保留在腫瘤組織超過(guò)了24h。在生物體系研究方面，SERS可以直接用于分析水相生物分子的結(jié)構(gòu)狀態(tài)研究且所需樣品用量少。將SERS技術(shù)用于生物研究的先驅(qū)是Koglin、Nabiev和Cotton等。此后，大量的研究工作證實(shí)了這一技術(shù)能夠解決生物化學(xué)，生物物理和分子生物學(xué)中的很多問(wèn)題，如蛋白質(zhì)，核酸及其組分等的分析與鑒別，生物分子的某些基團(tuán)與界面的相互作用研究，生物分子與金屬表面的鍵合方式等。
4結(jié)束語(yǔ)
本文討論了SERS的基本原理和增強(qiáng)機(jī)制，重點(diǎn)介紹了基于SERS的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，并探討了SERS的細(xì)胞成像、活體成像等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。SERS成像作為一種快捷、高效、無(wú)損、高靈敏度的檢測(cè)手段，在生物醫(yī)學(xué)、藥物、食品檢測(cè)等領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力，特別是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的細(xì)胞成像、腫瘤識(shí)別等方面的研究更具有重要價(jià)值。同時(shí)，SERS成像也面臨一些問(wèn)題，如每個(gè)像元的積分時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、SERS探針的制備困難等等。目前開(kāi)展的工作仍處于臨床前研究階段，要實(shí)現(xiàn)SERS成像技術(shù)在腫瘤疾病臨床診斷上的實(shí)際應(yīng)用還需要各個(gè)不同學(xué)科領(lǐng)域的研究者加強(qiáng)溝通與合作。
作者：王東方 宋世平 單位：中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)