柚苷酶應(yīng)用下食品工業(yè)論文

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1柚苷酶酶活測(cè)定方法

1.1Davis紫外分光光度計(jì)法

現(xiàn)在多采用改良后的Davis測(cè)酶活方法，該種方法也是測(cè)定酶活應(yīng)用最多的一種。但缺點(diǎn)是后期紫外分光光度計(jì)時(shí)會(huì)受到底物顏色的限制，柚皮苷為黃色溶液，可能影響柚皮苷含量的測(cè)定，進(jìn)而使測(cè)定的酶活不準(zhǔn)確，并且僅是對(duì)底物柚皮苷的含量測(cè)定來獲得柚苷酶的酶活力大小，無法知道組成該酶的其他酶α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的酶活力情況。

1.2高效液相色譜儀測(cè)定柚皮苷含量

用高效液相色譜來測(cè)定柚苷酶水解的底物柚皮苷的含量，不僅可以測(cè)定柚苷酶的酶活力，同時(shí)還可以測(cè)得α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的酶活力大小，使酶活測(cè)定精確具體化，檢測(cè)柚皮苷的精確度高，誤差小，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，但是操作較前一種Davis法繁瑣，時(shí)間延長(zhǎng)。對(duì)于不同的柚苷酶，高效液相色譜法檢測(cè)分析的實(shí)驗(yàn)條件不同。陳月龍?jiān)谄湔撐闹胁捎酶咝б合嗌V測(cè)定酶活時(shí)的流動(dòng)相選取的是甲醇、水、乙腈并采用不同梯度洗脫分離柚苷酶水解后的產(chǎn)物，從其結(jié)果中可看出實(shí)現(xiàn)了柚皮苷、柚皮素與普魯寧的完全分離。鄧媛等也采用高效液相色譜對(duì)柚苷酶活力以及普魯寧酶活力進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行了酶促動(dòng)力學(xué)研究，得出柚苷酶酶解的最佳條件。高效液相色譜法測(cè)定柚皮苷含量的優(yōu)點(diǎn)是直接反映酶解作用的各種產(chǎn)物含量，可獲得該酶所包含的各種酶的酶活力大小，方法準(zhǔn)確直觀，直接測(cè)得不同酶活力大小，缺點(diǎn)是操作較復(fù)雜。

2微生物來源柚苷酶的制備

2.1柚苷酶產(chǎn)生菌株的篩選

有效的微生物篩選方法可以大量節(jié)約菌株篩選的時(shí)間和成本，因此在篩選柚苷酶產(chǎn)生微生物的過程中選擇合適的篩選方法至關(guān)重要。目前微生物的篩選方法有透明圈法、高層試管法以及定性濾紙顯色法，其中高層試管法和定性濾紙法誤差較大，相較而言，透明圈法操作簡(jiǎn)單，觀察方便，適用于定性篩選，是目前應(yīng)用較為廣泛的一種篩選微生物方法。

2.1.1透明圈法透明圈法是指微生物分解平板培養(yǎng)基中溶解性較差的底物，使菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)該菌株利用底物的能力。盧建明等人研究發(fā)現(xiàn)將菌懸液涂布于長(zhǎng)有菌落的培養(yǎng)基內(nèi)，能分解柚皮苷產(chǎn)柚苷酶的菌落在四周就會(huì)出現(xiàn)一圈肉眼可見的透明圈，但是該種方法存在誤差并不能有效判斷菌株產(chǎn)柚苷酶狀況。陳玲等改良了柚苷酶平板透明圈篩選模型，利用硫酸二乙酯（DES）能與培養(yǎng)基中未分解的底物柚苷發(fā)生黃色反應(yīng)這一原理，加入一定比例的硫酸二乙酯（DES）混合液，反應(yīng)后菌落周圍出現(xiàn)了肉眼清晰可見的透明圈。這種方法加大了透明層與外圍未分解培養(yǎng)基的顏色對(duì)比，便于觀察和測(cè)量透明圈的大小，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟，提高了菌種篩選效率，是目前應(yīng)用最為廣泛的一種柚苷酶產(chǎn)生菌株的篩選方法。

2.1.2高層試管法高層試管法的原理是通過菌體在試管培養(yǎng)基中產(chǎn)酶并逐漸擴(kuò)散開，分解培養(yǎng)基中所含柚皮苷產(chǎn)生的透明層來判斷菌株的產(chǎn)酶能力大小，但是此方法也不易觀察區(qū)分開透明層的界限使判斷有誤差。3.1.3定性濾紙顯色法定性濾紙顯色法是利用柚皮苷水解后不顯色來區(qū)分產(chǎn)不產(chǎn)生柚苷酶分解柚皮苷，柚皮苷在培養(yǎng)基中既作為產(chǎn)酶的誘導(dǎo)物，又作為酶的底物在顯色時(shí)作指示劑，一次性加入簡(jiǎn)化了分析的操作步驟。但是文獻(xiàn)中采用較少，目前應(yīng)用最多的仍為透明圈法，有待開發(fā)出新的高效篩選產(chǎn)柚苷酶微生物的方法。

2.2柚苷酶產(chǎn)生菌株的改良

通過傳統(tǒng)篩選方法從自然環(huán)境中篩選的野生菌株的產(chǎn)酶能力一般不高，且篩選方法工作量大，效率低。因此有必要運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)（如原生質(zhì)體誘變育種、基因工程育種等）對(duì)天然菌株進(jìn)行改良獲得柚苷酶高產(chǎn)菌株，以便得到適合工業(yè)化生產(chǎn)的菌株，使得在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。其中原生質(zhì)體誘變育種包括物理誘變與化學(xué)誘變。

2.2.1物理誘變物理誘變育種技術(shù)目前已成為工業(yè)上微生物育種中最為常用和最有效的技術(shù)之一，對(duì)微生物誘變效果比較好而且應(yīng)用廣泛的主要有紫外線、x射線、射線和快中子等。以上誘變技術(shù)所用的設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，利用這些誘變?cè)催M(jìn)行單一或者復(fù)合誘變已經(jīng)得到大量的高產(chǎn)工業(yè)微生物菌株，在工業(yè)微生物的誘變中發(fā)揮著重要的作用。陳玲等采用不同的紫外線照射時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶菌株孢子進(jìn)行誘變處理，得到1株搖瓶發(fā)酵單位為500U/mL的菌株，比出發(fā)菌株的產(chǎn)酶能力提高了近30%。物理誘變方法并不是單一因素誘變，可選擇多種誘變方式復(fù)合，以獲得更優(yōu)良的產(chǎn)柚苷酶菌株。

2.2.2化學(xué)誘變化學(xué)誘變的優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)方便（只需少量的藥劑和簡(jiǎn)單的設(shè)備）、具有一定的專一性，應(yīng)用廣泛。陳玲等用亞硝基胍（NTG）對(duì)柚苷酶生產(chǎn)菌出發(fā)菌株孢子進(jìn)行誘變處理，得到1株搖瓶發(fā)酵單位達(dá)770.06U/mL的菌株，比出發(fā)菌株的產(chǎn)酶能力提高了近100%。汪釗等用硫酸二乙酯（DES）處理產(chǎn)柚苷酶菌株，正變率高達(dá)50%。

2.2.3基因重組技術(shù)基因重組技術(shù)即是將目的基因通過基因工程技術(shù)導(dǎo)入到受體細(xì)胞中并表達(dá)，目前已有關(guān)于α-L-鼠李糖苷酶通過埃希氏大腸桿菌克隆和表達(dá)的相關(guān)報(bào)道，Miyata將Sphingomonaspaucimobilis菌株中編碼rhaM的基因進(jìn)行克隆，于E.coli中成功表達(dá)，Birgisson等人從新型嗜熱細(xì)菌中克隆出兩種熱穩(wěn)定性的α-L-鼠李糖苷酶基因，分別為rhmA和rhmB，并在大腸桿菌中表達(dá)，Hashimoto等從Bacillussp.中獲得rhaA和rhaB兩種α-L-鼠李糖苷酶，轉(zhuǎn)入大腸桿菌克隆表達(dá)。α-L-鼠李糖苷酶基因重組技術(shù)使得柚苷酶更易獲得且更經(jīng)濟(jì)，在食品工業(yè)和制藥工業(yè)將獲得更大的用途。但由于柚苷酶由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成，并不是單一的酶系，所以使得產(chǎn)柚苷酶微生物的基因工程育種難度較大，必須對(duì)兩種酶的結(jié)構(gòu)性質(zhì)深入研究，掌握兩種酶在應(yīng)用中的相互關(guān)系，才可能構(gòu)建基因工程菌直接發(fā)酵生產(chǎn)出柚苷酶。

2.3柚苷酶的發(fā)酵制備

柚苷酶的發(fā)酵制備方法主要是固態(tài)發(fā)酵法和液態(tài)發(fā)酵法。固態(tài)發(fā)酵是指在沒有或幾乎沒有自由水存在情況下，在具有一定濕度的水不溶性固態(tài)基質(zhì)中，進(jìn)行一種或多種微生物發(fā)酵的工藝過程。相比于液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵時(shí)間更短。

2.3.1固態(tài)發(fā)酵研究1996年汪釗對(duì)黑曲霉ZG86進(jìn)行柚苷酶固體發(fā)酵研究，得出結(jié)論當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始含水量為52%～65%時(shí)，可以更好的地促進(jìn)菌體合成柚苷酶，使發(fā)酵周期從115h縮短至60h左右，大大減少了發(fā)酵時(shí)間，產(chǎn)酶活力可達(dá)15000U/g豆餅粉。Elinbaum等人研究了土曲霉CECT2663生產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的固態(tài)發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)柚皮苷比鼠李糖更加適合作為生產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的誘導(dǎo)物，同時(shí)證實(shí)了固態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵時(shí)間更短。固態(tài)發(fā)酵設(shè)備投資成本較少，能源消耗低，使其對(duì)環(huán)境的污染少，并且技術(shù)簡(jiǎn)單容易操作，再加上培養(yǎng)基的來源廣價(jià)格低使固態(tài)發(fā)酵法在生產(chǎn)柚苷酶方面應(yīng)用范圍廣，它具備自動(dòng)控制能力，但缺點(diǎn)是得到的酶活性較低，后期分離純化困難。

2.3.2液態(tài)發(fā)酵研究液體發(fā)酵法是是目前工業(yè)生產(chǎn)柚苷酶的主要發(fā)酵方式，指的是發(fā)酵用培養(yǎng)基呈液態(tài)的微生物培養(yǎng)過程，整個(gè)發(fā)酵過程自動(dòng)化程度高，不易收到污染，得到的柚苷酶在后期純化過程較固態(tài)發(fā)酵法容易，液態(tài)發(fā)酵法可分為液體表面發(fā)酵法和液體深層發(fā)酵法，其中液體深層發(fā)酵法是目前發(fā)酵工業(yè)中普遍使用的一種方法。隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展以及用于發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備的快速改進(jìn)，使得以液體發(fā)酵法生產(chǎn)商品酶制劑的成本正在逐步下降，因此更加有利于柚苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

2.3.3發(fā)酵罐高效密度發(fā)酵目前柚苷酶發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)的不成熟和制劑化工藝的缺乏，導(dǎo)致成品柚苷酶酶制劑價(jià)格高昂，這嚴(yán)重限制了柚苷酶應(yīng)用技術(shù)的開發(fā)，因此建立成熟的柚苷酶規(guī)?；l(fā)酵技術(shù)和合理的制劑化工藝具有重要意義。發(fā)酵罐高效密度發(fā)酵是將每一種成熟的發(fā)酵產(chǎn)品從實(shí)驗(yàn)室研究走向工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的必經(jīng)之路的方法。丁濤等人的論文中柚苷酶以200L規(guī)模的發(fā)酵放大，并研究發(fā)現(xiàn)在不同發(fā)酵規(guī)模中，α-L-鼠李糖苷酶活力出現(xiàn)最大值的發(fā)酵時(shí)間表現(xiàn)出有所不同的現(xiàn)象，并且最高α-L-鼠李糖苷酶活力可達(dá)1091U/mL。目前關(guān)于柚苷酶液態(tài)發(fā)酵的研究主要為一些小規(guī)模范圍，如搖瓶發(fā)酵和10L發(fā)酵罐的研究，涉及到柚苷酶發(fā)酵規(guī)模系統(tǒng)性放大的研究還報(bào)道還較少，有待進(jìn)一步的研究與開發(fā)。

3柚苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用

柚苷酶能將柚皮苷分解成無苦味物質(zhì)，故在果汁的脫苦方面起到關(guān)鍵酶的作用，對(duì)于柑桔加工業(yè)的發(fā)展有著十分重要的意義，社會(huì)對(duì)柚苷酶的需求越來越大，但目前柚苷酶的主要生產(chǎn)途徑卻面臨著微生物發(fā)酵效率低、成本偏高等問題。同時(shí)由于高產(chǎn)菌株的缺乏，國內(nèi)還沒有大量可用于工業(yè)化生產(chǎn)的商品酶制劑，而在生產(chǎn)實(shí)踐中使用進(jìn)口柚苷酶將會(huì)使企業(yè)生產(chǎn)成本大大增加。柑桔加工過程中的脫苦難題一直是制約柑桔加工業(yè)的一大瓶頸，與此相關(guān)的技術(shù)研究和成果必將推動(dòng)柑桔加工產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和柑桔種植業(yè)的發(fā)展，具有十分重要的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)意義。以下是柚苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

3.1果汁的脫苦

許多柑桔類水果已被加工成為果汁產(chǎn)品，但是加工過程中出現(xiàn)的后苦味，致使消費(fèi)者在口感上難以接受，因而降低了果汁的品質(zhì)，柑桔類水果的商業(yè)價(jià)值由于其自身產(chǎn)生的不良苦味而受到限制。酶法脫苦具有專一性強(qiáng)、脫苦效果好、操作簡(jiǎn)單、脫苦條件溫和、脫苦效果好，對(duì)果汁中其他營養(yǎng)成分及風(fēng)味無破壞、酶法安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，是目前較為理想并最具產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景的果汁脫苦方法，必將成為今后柑橘類脫苦研究的趨勢(shì)。汪釗等利用黑曲霉ZG86經(jīng)固態(tài)發(fā)酵得到的柚苷酶，柚苷酶加酶量16U/100ppm柚皮苷對(duì)柑橘果汁進(jìn)行脫苦，苦味脫除率達(dá)90%。

3.2提高葡萄酒的風(fēng)味

1994年Caldini等將真菌葡萄糖苷酶固定在固體載體上，其目的是連續(xù)作用于葡萄酒，促進(jìn)風(fēng)味的改善，增加酒的風(fēng)味，同時(shí)也對(duì)系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)行為和固定化進(jìn)行了研究。研究α-L-鼠李糖苷酶的活性條件及酶學(xué)性質(zhì)對(duì)于確定最佳反應(yīng)條件起到重要作用，為葡萄汁和葡萄酒的生產(chǎn)提供糖苷酶增香調(diào)控的理論參數(shù)，從而在提高葡萄汁和葡萄酒的質(zhì)量和檔次上具有重要的意義

3.3改善飲料的香氣成分和生產(chǎn)食品添加劑

柚苷酶組成酶系中的α-L-鼠李糖苷酶在食品中的應(yīng)用可改善飲料的香氣成分和生產(chǎn)食品添加劑，水解柑桔汁中的柚皮苷和檸檬苦素以去除柑桔汁中的苦味，從而使柑桔汁酸甜可口，口味宜人，原理是通過水解飲料中的類黃酮糖苷、糖甙類物質(zhì)增加水果中黃烷醇物質(zhì)，從而改善水果的功能特性，也是柚苷酶水解脫苦反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，這種水解作用在飲料中具有廣泛應(yīng)用，因此食品工業(yè)中可以用其改善飲料中的香氣成分，包括橘子汁、綠茶、黑醋栗汁等，也可以水解橘皮苷生產(chǎn)甜味劑的前體物，使食品獲得新的高聚物成分從而改善食品的流變特性，因而在生產(chǎn)食品添加劑中具有重要應(yīng)用。

4展望

目前限制柚苷酶的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用方面存在兩個(gè)問題：第一個(gè)問題是我國缺乏適合工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)酶菌株，發(fā)展出新的高效的篩選方法目前的當(dāng)務(wù)之急。第二個(gè)問題是柚苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)在國內(nèi)還存在著很多的缺陷，在工業(yè)化生產(chǎn)中使用的試劑或載體存在成本偏高、酶法效率低下、穩(wěn)定性較差、連續(xù)操作使用的設(shè)備較復(fù)雜等缺點(diǎn)，這就需要我們國家進(jìn)一步開發(fā)出更簡(jiǎn)便同時(shí)更適用的應(yīng)用于工業(yè)上的方法，柚苷酶應(yīng)用于柑桔及其他制品的脫苦與加工國外已有相關(guān)報(bào)道，但在我國柚苷酶并沒有在工業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用，主要原因是國內(nèi)尚無大規(guī)?？捎糜诠I(yè)生產(chǎn)制備的商品柚苷酶出售。今后我們應(yīng)加強(qiáng)關(guān)于柚苷酶高產(chǎn)菌株的選育方法以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化等基礎(chǔ)研究工作，作為以后發(fā)展的重要方向特別要注意利用現(xiàn)代分子水平通過DNA基因重組技術(shù)，選育出活性高、產(chǎn)酶量大的優(yōu)良理想菌株。

作者：朱運(yùn)平 郗夢(mèng)露 白雪 李秀婷 劉瑞山 單位：北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 河南省淼雨飲品股份有限公司