稻曲病菌感染機(jī)制探究

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本文作者：胡東維、王疏 單位：浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

稻曲病菌的分類地位和基本生物學(xué)性狀

稻曲病菌最早是Cooke對(duì)采自印度標(biāo)樣研究的基礎(chǔ)上，將其命名為UstilagovirensCooke，即黑粉菌屬一個(gè)種；隨后Patouillard對(duì)來(lái)自于日本稻曲病標(biāo)樣進(jìn)行了獨(dú)立研究，將其命名為TilletiaoryzaePat.，即稻腥黑粉菌屬一個(gè)種；1895年Brefeld認(rèn)為TilletiaoryzaePat.的發(fā)育與產(chǎn)孢模式類似于狗尾草上的一種無(wú)性階段，叫做Ustilaginoidea（綠核菌）屬的子囊菌，因此將稻曲病菌劃歸到Ustilaginoidea屬中，更名為U.oryzae（Pat.）Brefeld[1-2]。直到1934年Sakurai才發(fā)現(xiàn)了該病原菌的有性孢子，即菌核萌發(fā)產(chǎn)生子囊孢子，從此該菌被歸于子囊菌的麥角菌屬（Claviceps），但因一系列原因未獲得有效命名。直到2008年Tanaka在比較研究的基礎(chǔ)上將其從麥角菌屬中獨(dú)立出來(lái)，將其有性態(tài)定名為Villosiclavavirens[2]。

稻曲病的癥狀只出現(xiàn)在水稻的穗部，只在個(gè)別小花上產(chǎn)生黃色至深綠色的球狀病原菌菌落。此前水稻植株的葉片、莖稈等部位沒(méi)有任何異常癥狀。在田間自然條件下，一般在水稻開(kāi)花后1周左右開(kāi)始有幼嫩的稻曲球出現(xiàn)，開(kāi)花3周后稻曲球體積達(dá)到最大并在其外圍產(chǎn)生大量的厚垣孢子[1]。在一定環(huán)境條件下，在水稻成熟晚期稻曲球的表面可形成一至數(shù)個(gè)形狀不規(guī)則的菌核，菌核可在一定條件下萌發(fā)產(chǎn)生子囊孢子[2,13-14]。稻曲病菌在各種固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)十分緩慢，長(zhǎng)滿一個(gè)9cm直徑的培養(yǎng)皿至少需要25—30d。在培養(yǎng)14d后可開(kāi)始產(chǎn)生少量薄壁的分生孢子，培養(yǎng)約20d后可開(kāi)始產(chǎn)生厚垣孢子；在液體培養(yǎng)基中，稻曲病菌只產(chǎn)生橢圓形的、薄壁的分生孢子；厚垣孢子萌發(fā)分生孢子，但厚垣孢子在室內(nèi)條件下保存會(huì)很快喪失其萌發(fā)能力[15-16]。稻曲病菌的菌核可萌發(fā)進(jìn)行有性生殖并產(chǎn)生子囊孢子，子囊孢子萌發(fā)則產(chǎn)生類似于液體培養(yǎng)產(chǎn)生的薄壁分生孢子[17]。厚垣孢子和子囊孢子萌發(fā)后最終都會(huì)形成薄壁小孢子[17]。稻曲病菌菌核在來(lái)年春季需2個(gè)月以上的時(shí)間方可萌發(fā)產(chǎn)生子囊孢子。大部分的菌核在稻田環(huán)境條件下難以越冬并成為來(lái)年的主要初侵染源[13]。

稻曲病菌對(duì)水稻幼苗的侵染

早在20世紀(jì)60年代，Ikegami就對(duì)稻曲病菌的苗期侵染進(jìn)行了組織學(xué)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌可以成功侵染水稻萌發(fā)初期的幼嫩胚芽鞘，并沿著韌皮部中的篩管外表面進(jìn)行擴(kuò)展，直至分蘗的中晚期；但并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)稻曲病菌能夠像黑粉菌那樣抵達(dá)植株莖尖部的穗原基[18-19]。鄭大偉等發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌菌絲在侵染點(diǎn)處稍稍膨大，形成類似于附著胞結(jié)構(gòu)，然后侵入水稻胚芽鞘表皮細(xì)胞的角質(zhì)層下生長(zhǎng)，繼而以胞外擴(kuò)展的方式進(jìn)入組織深層（圖1）[20]。稻曲病菌不能成功侵入水稻葉片，也沒(méi)有檢測(cè)到能夠侵入根部。但在后續(xù)幾年的田間試驗(yàn)中，苗期成功接種的幼苗，在田間條件下并未發(fā)病。需要指出，2009—2011年中國(guó)稻曲病僅零星發(fā)生，是否存在大氣候環(huán)境的影響，則尚未明確。Ditmore等近年來(lái)也對(duì)稻曲病菌的苗期侵染進(jìn)行了研究。細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)稻曲病菌可侵染水稻幼嫩的胚根；同時(shí)PCR檢測(cè)表明病原菌可擴(kuò)展至整個(gè)植株包括穗和籽粒[21-23]。

中國(guó)許多學(xué)者多年來(lái)對(duì)水稻種子帶菌是否可導(dǎo)致水稻發(fā)病問(wèn)題做了大量的田間比較研究，部分結(jié)果表明種子帶菌可導(dǎo)致水稻發(fā)病[24-25]，而一些研究結(jié)果則相反[26]。也有試驗(yàn)表明苗期和抽穗期均可成功侵染[27]。分析這些結(jié)果，其共同點(diǎn)均是最終病穗率都比較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于高發(fā)病年份高感品種田間自然發(fā)病率，因此需要更多年份的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。此外，缺乏帶有特殊標(biāo)記的稻曲病菌菌株，也使得上述研究是否真正誘發(fā)侵染仍存質(zhì)疑。Tang等采集了田間自然發(fā)病的病粒數(shù)高的重病穗，然后對(duì)其穗軸和稻曲球下的小穗軸進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)觀察，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病菌菌絲的存在，說(shuō)明所檢測(cè)的稻曲球是病原菌穗部局部侵染導(dǎo)致[28]，從一個(gè)側(cè)面說(shuō)明稻曲病菌在苗期侵染后，在自然條件下很難或不能有效擴(kuò)展到穗部并引發(fā)病害。

水稻孕穗期稻曲病菌的侵染

稻曲球是稻曲病的唯一可見(jiàn)癥狀，因此大部分學(xué)者認(rèn)為稻曲病菌的侵染應(yīng)該在孕穗或開(kāi)花期。國(guó)內(nèi)外大量的穗部接種試驗(yàn)表明，孕穗期接種能夠大幅度提高水稻的發(fā)病率，其中一些新的注射接種方法可以使病穗率達(dá)到100%，單穗病粒數(shù)也比較高[29-32]。對(duì)于稻曲球發(fā)育過(guò)程早在100年前就有了簡(jiǎn)單的觀察和描述，認(rèn)為稻曲病菌的侵染可分為明顯不同的2個(gè)時(shí)期，即在小花發(fā)育的早期和籽粒成熟后期，其中早期侵染導(dǎo)致子房破壞，但花藥和柱頭仍保持完整；而后期侵染可導(dǎo)致部分或所有胚乳被菌絲取代[1]。王國(guó)良對(duì)稻曲球的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了系統(tǒng)、細(xì)致的解剖觀察，發(fā)現(xiàn)孕穗早期水稻小花柱頭和子房上有大量菌絲的積累，由此推斷病菌應(yīng)是從水稻的柱頭侵入的，侵入后由子房、柱頭提供營(yíng)養(yǎng)，迅速向花藥及整個(gè)穎花內(nèi)腔發(fā)展蔓延，最后形成稻曲病菌厚垣孢子球[33]。劉水芳等也得到了類似的結(jié)論[34-35]。蔡洪生等利用人工接種方法，發(fā)現(xiàn)稻曲病菌菌絲最先出現(xiàn)在花絲和花藥上，后來(lái)才出現(xiàn)在柱頭上[36]。但上述研究均沒(méi)有嚴(yán)格的組織病理學(xué)觀察，沒(méi)有在組織或細(xì)胞內(nèi)部檢測(cè)是否存在病原菌。

Tang等利用人工接種方法，挑取早期侵染的小花，然后對(duì)整個(gè)小花進(jìn)行固定和樹(shù)脂包埋，繼而對(duì)整個(gè)小花的連續(xù)半薄切片進(jìn)行觀察，同時(shí)對(duì)重點(diǎn)部位進(jìn)行定位和超薄切片觀察[28]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稻曲病的初侵染位點(diǎn)是水稻的花絲組織，并最易侵染位于子房和漿片之間的3個(gè)花絲（圖2）。連續(xù)切片的分析結(jié)果也表明，稻曲病菌從不侵染水稻子房和花藥，但偶爾會(huì)有次生菌絲侵染柱頭和漿片的外圍組織。病原菌侵染模式屬于細(xì)胞外侵染和擴(kuò)展，病原菌菌絲不直接穿透和進(jìn)入寄主細(xì)胞，只在細(xì)胞間穿行，并最終將花絲組織的細(xì)胞壁完全降解。在稻曲球發(fā)育過(guò)程中，稻曲病菌雖然產(chǎn)生毒素但并不殺死寄主細(xì)胞，因此稻曲病菌屬活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌[28]。這在機(jī)制上與一般的活體營(yíng)養(yǎng)型及死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌均有所不同[37]，比較少見(jiàn)。張震等也指出雜交水稻的不育系比較感病[35]。這說(shuō)明不同水稻品種的花絲可能在發(fā)育和結(jié)構(gòu)等方面存在差異。到目前為止，幾乎所有對(duì)新鮮稻曲球的解剖都表明，稻曲球內(nèi)含有6個(gè)水稻花藥[28,33,35,38]。加之稻曲病菌不能侵染幼嫩的子房，所以侵染成熟籽粒的可能性更小。至今還沒(méi)有組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的證據(jù)證明稻曲病菌能夠侵染幼嫩的或成熟的水稻籽粒。

病原菌孢子萌發(fā)特性與水稻發(fā)育的時(shí)空關(guān)系

除了細(xì)胞學(xué)對(duì)侵染過(guò)程的檢測(cè)外，探討病原菌產(chǎn)孢類型、孢子萌發(fā)習(xí)性以及水稻發(fā)育時(shí)期，對(duì)于制定侵染機(jī)制研究的策略與途徑有非常重要的幫助。稻曲球外層是大量的厚垣孢子，厚垣孢子萌發(fā)后可產(chǎn)生數(shù)個(gè)薄壁的小孢子，這些小孢子可用于接種和侵染水稻[1,3-4,39]。但是厚垣孢子在室內(nèi)條件下的存活能力非常有限，并在1個(gè)月后大部分孢子失去萌發(fā)能力[16]。因此，水稻產(chǎn)區(qū)當(dāng)?shù)氐暮裨咦又贿m合作為水稻苗期的初侵染源。當(dāng)然，早熟水稻產(chǎn)生的厚垣孢子也可以作為晚熟水稻的侵染源。同樣，通過(guò)大氣長(zhǎng)距離傳播，早熟稻區(qū)的厚垣孢子也可以侵染晚熟稻區(qū)的水稻。

在自然狀態(tài)下稻曲球上往往會(huì)產(chǎn)生菌核，成熟的菌核往往能夠存活一至數(shù)年。但對(duì)于子囊孢子致病性和菌核在中國(guó)的分布等情況的研究還很缺乏[4,13]。有研究表明，菌核在田間的萌發(fā)往往需要數(shù)月的時(shí)間，萌發(fā)后所產(chǎn)生子囊孢子的時(shí)期與東北、四川等地水稻孕穗期比較接近，因此可能是適宜的初侵染源[13]。目前對(duì)于稻曲病菌菌核的研究也相對(duì)較少。云南、四川、貴州、東北、西北等溫差較大地區(qū)菌核比較常見(jiàn)，而長(zhǎng)江中下游地區(qū)、華南和福建相對(duì)較少。其實(shí)至少在長(zhǎng)江中下游地區(qū)菌核也普遍存在，只不過(guò)往往發(fā)生在晚熟的品種上，采集和調(diào)查最好在水稻收獲前的數(shù)天進(jìn)行；田間調(diào)查的時(shí)間太早會(huì)得出菌核缺失的假象。印度學(xué)者的研究也發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌菌核多出現(xiàn)在高海拔地區(qū)[14]，也說(shuō)明低溫或較大的晝夜溫差有利于菌核的形成。進(jìn)一步研究不同稻區(qū)菌核產(chǎn)生的多少及其成熟度、菌核在自然條件下的存活率與萌發(fā)過(guò)程，對(duì)于確定它能否作為主要初侵染源至關(guān)重要。

稻曲病菌中間寄主

另外一個(gè)問(wèn)題是，是否存在稻曲病菌的中間寄主及其在病害循環(huán)中的作用。Shetty等發(fā)現(xiàn)旱黍草上發(fā)現(xiàn)類似稻曲球的病原菌，將水稻和旱黍草上2個(gè)不同來(lái)源的病原菌交叉接種可致病[40]。Atia則報(bào)道在埃及發(fā)現(xiàn)稗草和白茅2種雜草可感染稻曲病[7]。中國(guó)黎毓干等報(bào)道在鼠尾粟上發(fā)現(xiàn)了類似稻曲病的病粒[41]。在中國(guó)很多地區(qū)的稻田都有人發(fā)現(xiàn)過(guò)帶有類似癥狀的雜草，但由于研究手段的限制，這些研究或未進(jìn)行病原菌分離，或未進(jìn)行分子生物學(xué)的驗(yàn)證。另外，就其普遍程度來(lái)說(shuō)，這類雜草被感染的情況是比較罕見(jiàn)的，因此對(duì)稻曲病菌初侵染的貢獻(xiàn)估計(jì)不會(huì)很大。

問(wèn)題與展望

從現(xiàn)有的證據(jù)來(lái)看，稻曲病菌孕穗期侵染無(wú)疑是一種主要侵染方式。但是厚垣孢子還是子囊孢子作為主要初侵染源尚不清楚。其中子囊孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)試驗(yàn)在方法上尚存在一些困難。對(duì)稻曲病重災(zāi)區(qū)的菌核產(chǎn)生情況以及子囊孢子的致病性研究應(yīng)是未來(lái)研究的重要方向。

對(duì)于病原菌苗期侵染及其擴(kuò)展問(wèn)題，首先要有適當(dāng)?shù)膸в刑厥鈽?biāo)記的菌株、病原菌原位檢測(cè)的方法和建立一整套適宜水稻發(fā)病的栽培管理措施。Wang等分離到一個(gè)致病性良好的白化菌株，為苗期侵染的觀察提供了直觀的標(biāo)記[42]。另外，日本[43]及中國(guó)浙江大學(xué)、西北農(nóng)林科技大學(xué)、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院等多家實(shí)驗(yàn)室均通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化得到了帶GFP標(biāo)記的菌株；但帶有GFP菌株的穩(wěn)定性和致病性尚待觀察，目前發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌株中GFP丟失現(xiàn)象很常見(jiàn)。此外，王永強(qiáng)等的研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)稻曲病菌的rDNA-IGS序列分為6種長(zhǎng)度類型，其中＞96%稻曲球均為400bp的常見(jiàn)型，另外5類型為稀有型[44]（其中一罕見(jiàn)類型未發(fā)表，GenBank登錄號(hào)為JN036608）；用這些稀有型菌株進(jìn)行苗期接種，并使用對(duì)植株的整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中的不同器官和最終植株上產(chǎn)生的稻曲球進(jìn)行rDNA-IGS序列長(zhǎng)度多態(tài)性的PCR檢測(cè)，就能夠有效避免田間稻曲病菌孢子對(duì)分子檢測(cè)的干擾，客觀了解稻曲病菌在水稻體內(nèi)的擴(kuò)展過(guò)程。

從技術(shù)層面來(lái)講，完整的細(xì)胞學(xué)證據(jù)鏈?zhǔn)浅吻迩秩?a href="http://www.coffee125.com/lunwen/nybhfzlw/27458.html" target="_blank">機(jī)制必不可少的。Sesma等也正是這樣證實(shí)了稻瘟病菌具有系統(tǒng)性侵染的能力[45]。Zhou等建立了高靈敏度針對(duì)稻曲病菌的嵌套PCR方法[46]；但rDNA在基因組中重復(fù)次數(shù)較多，以其序列特征為基礎(chǔ)的PCR檢測(cè)難以完全排除植株表面病原菌孢子的干擾。所以篩選更多帶有特異性分子標(biāo)記的菌株至關(guān)重要。對(duì)于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)來(lái)說(shuō)，由于稻曲病菌菌絲特別纖細(xì)，在光學(xué)顯微鏡下單條菌絲在切片上往往不易捕捉，因此超微結(jié)構(gòu)分析是必不可少的。選擇遺傳穩(wěn)定、產(chǎn)孢量高、致病性強(qiáng)的GFP轉(zhuǎn)化菌株，利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行活體、連續(xù)跟蹤研究，是研究苗期侵染的理想方法。

目前已經(jīng)明確了稻曲病菌在穗部選擇性侵染水稻花絲，下一步研究的焦點(diǎn)則應(yīng)是侵染的生化機(jī)制。首先是為什么病原菌會(huì)選擇性的侵染水稻花絲組織？花絲的結(jié)構(gòu)發(fā)育和特定敏感時(shí)期的結(jié)構(gòu)特征、花絲表面物質(zhì)成分、病原菌胞間侵染的細(xì)胞壁降解酶、病原菌從花絲獲取營(yíng)養(yǎng)的機(jī)制、雜交水稻花絲敏感的原因與水稻抗病性改良途徑等將需要逐一進(jìn)行探討。在這方面，稻曲病菌的近緣病原真菌－麥角菌已有較好的研究積累[47-54]，可為稻曲病菌侵染機(jī)制的研究提供借鑒。此外，植物內(nèi)生真菌與寄主互作機(jī)制的研究方法，也可以加以利用[55]。