雞禽白血病與雞白痢凈化檢測的關(guān)系

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禽白血病(avianleukosis，AL)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科的禽白血病病毒(avianleukosisvirus，ALV)引起的禽類腫瘤性疾病之一。近年來，AL在我國的地方品系的雞群中廣泛流行［1］，發(fā)病率呈逐漸上升趨勢，給養(yǎng)雞場帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失;雞白痢(plorumdiseasePD)是由雞白痢沙門菌所引起的一種常見的傳染?。?］，是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的傳染?。?－4］。研究表明，母雞感染了雞白痢沙門氏菌后，會嚴(yán)重影響種蛋的孵化率及雛雞的成活率［5］，對此病的防治應(yīng)引起高度重視。禽白血病和雞白痢都具有水平傳播及經(jīng)蛋垂直傳播的特點(diǎn)，迄今為止，尚無有效疫苗及藥物可用于防治，只有通過種群凈化，淘汰陽性雞，才能有效地控制這兩種疾病的傳播。作為全國地方雞品種資源最為豐富的省份之一，近年來廣西部分養(yǎng)殖公司近年來已陸續(xù)開展禽白血病和雞白痢疾病凈化工作。本實(shí)驗(yàn)主要通過對廣西兩家養(yǎng)殖公司雞正處在凈化初始階段的3個地方優(yōu)質(zhì)雞進(jìn)行“兩白”(禽白血病和雞白痢)檢測結(jié)果比較，找出在這兩種疾病在凈化中二者的相關(guān)性。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1主要儀器酶標(biāo)儀(ThermoScientific，型號:Mti-skanFC);洗板機(jī)(Thermo，型號:ScientificWellwash);生物潔凈安全柜(上海，型號:BHC－1300IIA/B3);－80℃超低溫冰箱(型號:DW-HL340);CO2培養(yǎng)箱(Panasonic，型號:WCO－18AC);倒置顯微鏡(上海巴托，型號:XSP－17C)。

1．1．2主要試劑雞白?。u傷寒多價染色抗原，購自北京中海動物保健科技公司;禽白血病P27抗原檢測試劑盒，購自美國IDEXX公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基，購自GIBCO公司;DF－1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1．1．3樣品本實(shí)驗(yàn)所需的樣品，血清、蛋清和血漿，均采集自進(jìn)行凈化中的母雞，血清用于雞白?。u傷寒多價凝集抗原進(jìn)行的平板凝集試驗(yàn)，蛋清用于ALV-P27抗原d的ELISA檢測，血漿則用于接種DF－1細(xì)胞進(jìn)行的病毒分離以及隨后的ALV-P27抗原的ELISA檢測。

1．2方法

1．2．1技術(shù)線路對廣西兩家養(yǎng)殖公司地方優(yōu)質(zhì)雞黃雞、麻雞及瑤雞開產(chǎn)或留種前首先進(jìn)行雞白痢的檢測，挑選出檢測結(jié)果陽性的雞集中隔離飼養(yǎng)，對雞白痢陰性雞及部分陽性雞分別集其蛋清及采集其血漿進(jìn)行ALV的分離培養(yǎng)及其P27抗原的檢測，然后分析對比相關(guān)的檢測結(jié)果。見圖1。

1．2．2血清樣品的雞白痢檢測地方優(yōu)質(zhì)雞黃雞開產(chǎn)前(24W)，麻雞、瑤雞留種前(40W)采血(未加抗凝劑)，無菌分離血清，其中黃雞6068份、麻雞2871份、瑤雞345份，將樣品血清應(yīng)用雞白?。u傷寒多價染色抗原進(jìn)行雞白痢平板凝集試驗(yàn)，操作步驟:試驗(yàn)前保持操作環(huán)境在20℃～25℃室溫狀態(tài);將抗原回溫后搖勻，吸取25μL抗原滴于潔凈玻片上，再取25μL待檢血清置于抗原滴上，輕輕與抗原混勻并慢慢涂散開成直徑約2cm的薄層，輕輕晃動玻片，2min內(nèi)觀察結(jié)果并做好記錄。每次試驗(yàn)都要設(shè)陽性、陰性血清對照。試驗(yàn)結(jié)果判定:必須同時符合在陽性對照血清液體出現(xiàn)100%凝集以及陰性對照血清液體完全無凝集現(xiàn)象的前提下，判定結(jié)果為有效;2min內(nèi)出現(xiàn)明顯顆粒狀或塊狀凝集現(xiàn)象，判為陽性，在2min內(nèi)不出現(xiàn)凝集，或出現(xiàn)均勻一致的極微小顆粒，或在液體邊緣處由于臨干前顯絮狀等現(xiàn)象，均判為陰性，有別于上述反應(yīng)，不易判為陰性或陽性反應(yīng)的，可判為可疑反應(yīng)。

1．2．3樣品的禽白血病檢測(1)蛋清樣品P27抗原ELISA檢測。將雞白痢檢測結(jié)果為陰性和陽性的雞群隔離飼養(yǎng)后，分別對黃雞、麻雞雞白痢陰性雞及部分雞白痢陽性雞集蛋，無菌采集蛋清，反復(fù)凍融3次后，使用IDEXX公司禽白血病病毒抗原檢測試劑盒(AvianLeukosisVirusAntigenTestKit)對蛋清進(jìn)行P27抗原ELISA檢測，操作步驟參照試劑盒說明書。結(jié)果判斷:陽性對照A(650)平均值－陰性對照A(650)平均值＞0.2，陰性對照A(650)平均值≦0.15，則實(shí)驗(yàn)有效;樣品S/P＞0.2，為陽性;樣品S/P≦0.2，為陰性。(2)血漿樣品病毒分離及其檢測。將瑤雞雞白痢檢測結(jié)果為陰性和陽性的雞群隔離飼養(yǎng)后用一次性抗凝管(含有抗凝劑)及采集針采血，無菌分離血漿，將血漿接種到已長有70%～80%單層DF－1細(xì)胞的48孔細(xì)胞板中培養(yǎng)，每孔120，同時設(shè)兩孔DMEM培養(yǎng)液對照，放37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中浸染，2個小時后吸棄次細(xì)胞板內(nèi)的血漿，更換250含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，9天后收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次后用IDEXX公司禽白血病病毒抗原檢測試劑盒進(jìn)行P27抗原ELISA檢測。操作方法及結(jié)果判定同(1)。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1樣品雞白痢的檢測結(jié)果

廣西地方優(yōu)質(zhì)雞黃雞，開產(chǎn)前(24W)采集血清進(jìn)行雞白痢檢測，廣西地方品種麻雞、瑤雞留種前(40W)采集血清進(jìn)行雞白痢檢測。檢測結(jié)果見表1，黃雞、麻雞、瑤雞雞白痢陽性率分別為48.17%、18.88%、37.10%，雞白痢感染較嚴(yán)重。

2．2雞白痢陰性雞與陽性雞的禽白血病檢測結(jié)果

將雞白痢檢測結(jié)果為陰性和陽性的雞群隔離飼養(yǎng)后進(jìn)行禽白血病檢測，檢測結(jié)果見表2。黃雞雞白痢陰性雞3150只，檢出禽白血病陽性562份，陽性率17.84%，雞白痢陽性雞100羽，檢出禽白血病陽性26只，陽性率26.00%;麻雞雞白痢陰性雞2256只，檢出禽白血病陽性17只，陽性率0.38%，雞白痢陽性雞100只，檢出禽白血病陽性1份，陽性率1.00%;瑤雞雞白痢陰性雞217只，檢出禽白血病陽性19只，陽性率8.76%，雞白痢陽性雞128只，檢出禽白血病陽性15只，陽性率11.72%。如圖2，黃雞、麻雞、瑤雞雞白痢陽性雞的禽白血病陽性率均高于雞白痢陰性的雞。

3小結(jié)與討論

禽白血病和雞白痢在我國地方品種雞中感染已相當(dāng)普遍［6－8］，必須引起高度的重視。我國農(nóng)業(yè)部已將禽白血病和雞白痢陽性感染率作為一項(xiàng)硬性指標(biāo)正式列入種雞健康標(biāo)準(zhǔn)中。有研究表明，種雞場開展禽白血病和雞白痢的凈化可顯著提高雞群的產(chǎn)蛋率、降低死淘率和料蛋比，從而提高養(yǎng)雞經(jīng)濟(jì)效益，對促進(jìn)養(yǎng)雞業(yè)的健康和發(fā)展，做好地方品種雞的保種和選育工作具有一定的實(shí)際意義［9－10］。本研究發(fā)現(xiàn)，廣西兩家養(yǎng)殖公司地方優(yōu)質(zhì)雞黃雞、麻雞、瑤雞凈化雞群開產(chǎn)前或留種前雞白痢陽性率分別為48.17%、18.88%、37.10%，可見，雞白痢感染都比較嚴(yán)重，這3個地方優(yōu)質(zhì)雞正處于雞白痢凈化初始階段，堅信通過嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)檢測，及堅持做好生物安全措施，經(jīng)過幾個世代的凈化后一定能降低陽性率。將雞白痢檢測結(jié)果為陰性和陽性的雞群隔離飼養(yǎng)后進(jìn)行禽白血病檢測，黃雞、麻雞、瑤雞雞白痢陰性雞禽白血病陽性率分別為17.84%、0.38%、8.76%，雞白痢陽性雞禽白血病陽性率分別為26.00%、1.00%、11.72%。顯而易見，3個地方優(yōu)質(zhì)雞雞白痢陽性雞群中禽白血病陽性率都高于雞白痢陰性雞，說明雞白痢陽性的雞感染禽白血病病毒要比雞白痢陰性的雞要高，其中特別是黃雞的差異最明顯。目前平板凝集試驗(yàn)作為檢測雞白痢最常用的方法，具有操作簡單，反應(yīng)速度快，陽性檢出率高，也不影響種雞的按時開產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［11］。種雞進(jìn)行雞白痢檢測首次普檢時間一般為17W～20W，此段時間種雞處在性成熟階段，而且也是禽白血病排毒高峰期。從檢測結(jié)果數(shù)據(jù)看，在檢測禽白血病前進(jìn)行雞白痢檢測，在淘汰雞白痢陽性雞的同時也將一部分的禽白血病陽性雞淘汰了。因?yàn)榍莅籽〉臋z測成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于雞白痢檢測成本，這將在一定程度上來說也降低了檢測成本，即開產(chǎn)及留種前，在禽白血病檢測前先進(jìn)行雞白痢檢測淘汰陽性雞的方法是非常有價值的。

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作者：陸喬娥 高延利 石夢雅 李敏 李秋紅 鄧喬木 韋平 單位：廣西大學(xué)養(yǎng)禽與禽病學(xué)研究所