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關(guān)鍵詞 殼層隔絕納米粒子； 氰化物； 中毒血液樣品； 在線裂解吹掃捕集； 表面增強(qiáng)拉曼光譜
1 引 言
氰化物是一種廉價、速殺的血液性毒劑，中毒事件屢有發(fā)生[1～3]。氰化物吸收入體后，氰根可迅速與細(xì)胞線粒體內(nèi)高鐵細(xì)胞色素氧化酶結(jié)合，生成氰化高鐵細(xì)胞色素氧化酶，使其失去傳遞氧的作用，造成組織缺氧，最終導(dǎo)致機(jī)體窒息，甚至死亡[4]。氰化物屬于劇毒物質(zhì)，人體口服途徑的急性中毒致死劑量為0.48～3.37 mg/kg體重（氰根）[5]，在數(shù)分鐘內(nèi)即出現(xiàn)急性中毒癥狀。因此，盡早發(fā)現(xiàn)、及時干預(yù)是有效救治的基本原則，而血液氰化物含量的現(xiàn)場快速檢測是指導(dǎo)中毒救治的首要前提。
目前，針對氰化物中毒生物樣本常用的檢測方法包括目視比色法[6，7]、分光光度法[8]、氣相色譜法[9]、離子色譜法[10]及色譜質(zhì)譜法[11]等。其中，目視比色法和分光光度法等多利用氰化物和@色物質(zhì)間的定量反應(yīng)，靈敏度在0.01～ 1 mg/L水平，特異性較差； 而色譜（質(zhì)譜）等方法中，氰化物（氰根或氧化物）自身屬于高極性小分子物質(zhì)，除需衍生化或選擇特殊類型的色譜柱外，中毒生物樣品前處理過程復(fù)雜、耗時，使得上述方法僅適用于實驗室檢測。表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surfaceenhanced Raman spectroscopy， SERS）技術(shù)具有靈敏度高、指紋譜準(zhǔn)確識別、檢測速度快、適用于現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)點[12～16]，本課題組前期亦發(fā)展了芥子氣[17]、光氣[18]、百草枯[19]等化學(xué)毒劑毒物的SERS現(xiàn)場快速檢測方法。SERS技術(shù)在氰化物中毒現(xiàn)場檢測方面具有較大潛力。
本研究基于有孔殼層隔絕納米粒子（Pinhole shellisolated nanoparticles，pinSHINs），結(jié)合便攜式拉曼光譜，建立了一種血液氰化物快速SERS檢測新方法。PinSHINs極薄的有孔SiO2殼層能夠有效保護(hù)金核，極大地削弱了Au-CN配位形成可溶性復(fù)合物Au（CN）所導(dǎo)致的“溶金”效應(yīng)，使其具有比普通金納米粒子（AuNPs）更優(yōu)越的穩(wěn)定性[20，21]。
但是考慮到與血細(xì)胞中細(xì)胞色素氧化酶結(jié)合的氰化物難以被直接檢測，常用強(qiáng)酸使結(jié)合態(tài)氰化物釋放產(chǎn)生HCN，再進(jìn)行衍生化及分光光度法測定[8，22，23]，較為復(fù)雜、耗時。本研究構(gòu)建了血液中氰化物的在線裂解吹掃捕集方法，以濃H2SO4酸化全血樣品，將結(jié)合態(tài)氰化物裂解，并轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的HCN氣體，經(jīng)N2吹掃至堿液中形成NaCN，繼而直接對堿液進(jìn)行SERS檢測，其靈敏度高、特異性強(qiáng)，操作方便快速，檢出限達(dá)10 μg/L。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
所有SERS光譜于iRaman型便攜式拉曼光譜儀（美國 B&W TEK公司）上測定（激光波長785 nm，分辨率4.5 cm）。紫外可見吸收光譜（UVVis）于Cary 300型紫外可見分光光度計上（美國Varian公司）獲得。
NaCN（純度為99%，申領(lǐng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所毒劑庫）； Na2SiO3（美國Sigma公司）； NaOH（國藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑公司）； 3氨丙基三乙氧基硅烷（ATPMS，美國Alfa Aesar公司）； 消泡劑為本課題組自制（主要成分為脂肪酸酯）； 真空封泥（酒泉祁天特種油品有限公司）； 15 mL離心管及96孔酶標(biāo)板（美國Corning公司）； 肝素化采血管（江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司）。除特殊說明外，所有化學(xué)試劑均為分析純或以上。所有溶液均由超純水（MilliQ A10，美國Millipore公司）配制。雄性SD大鼠（SPF級180～200 g，北京維通利華動物實驗公司，許可證號：SCXK（京）20120001），飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心SPF級動物房。氰化物中毒患者全血樣品由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院中毒救治科提供。
2.2 實驗方法
2.2.1 殼層隔絕金納米粒子的制備 首先用Frens檸檬酸鈉還原法[24]合成粒徑約為55 nm的金納米粒子（AuNPs），向制備好的55 nm AuNPs中加入1 mmol/L APTMS溶液，攪拌15 min，再加入Na2SiO3溶液 （0.54%， w/w） 并攪拌3 min，使AuNPs表面包覆生成SiO2殼層。控制Na2SiO3溶液的pH>11，即可生成1～2 nm厚的有孔SiO2殼層[25]。
2.2.2 NaCN標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱量NaCN 10.00 mg，用0.01 mol/L NaOH溶液溶解并定容至10 mL， 得1.00 g/L NaCN對照品溶液，于4℃保存。使用時，以0.01 mol/L NaOH溶液稀釋得到濃度為0.005、0.05、0.5、5和50 mg/L的工作溶液。
2.2.3 血液氰化物在線裂解吹掃捕集裝置的構(gòu)建 血液氰化物在線裂解吹掃捕集裝置分為揮發(fā)裝置（A）、吸收裝置（B）和尾氣吸收裝置（C）三部分（圖1），3只15 mL離心管經(jīng)相同孔徑導(dǎo)管相連，導(dǎo)管連接處均經(jīng)真空泥密封，氣密性檢測表明裝置無漏氣。在裝置（A）中加入濃H2SO4，使結(jié)合態(tài)氰化物酸化裂解，生成HCN氣體，經(jīng)氮氣吹掃至裝置（B），被其中的NaOH溶液充分吸收，形成NaCN，對吸收液進(jìn)行SERS檢測； 裝置（C）連有一段活性炭管，以吸收多余的尾氣。在優(yōu)化條件下，裝置（A）中添加1 mL待測樣品、4 mL 12 mol/L H2SO4溶液和200 μL消泡劑（快速消除吹掃血樣時產(chǎn)生的大量泡沫，防止堵塞管路），裝置（B）和（C）中均加入1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液。
2.2.4 SERS檢測 取1 mL pinSHINs，5000 r/min離心5 min，去除上清液，與200 μL吸收液混合，移入96孔酶標(biāo)板，進(jìn)行SERS檢測。便攜式拉曼光譜儀參數(shù)為：激光功率90 mW，積分時間10 s。
2.2.5 NaCN染毒動物實驗 依據(jù)口服常用染毒劑量[26]及預(yù)實驗數(shù)據(jù)，按3 mg/kg（50%半數(shù)致死劑量LD50）的劑量向插管SD雄性大鼠灌胃染毒NaCN生理鹽水溶液，在注射之前抽取血液，設(shè)為“零”時間點。在注射后5 min，15 min， 30 min， 60 min， 2 h， 4 h和6 h各抽取血液500 μL于肝素化采血管中，按2.2.3和2.2.4進(jìn)行檢測。
3 結(jié)果與討論
3.1 PinSHINs的表征
以 UVVis 吸收光譜、TEM及 HRTEM 對 pinSHINs 進(jìn)行表征（圖2）。pinSHINs的最大紫外吸收峰位于536 nm處，半峰寬較窄，說明粒徑分布較均勻，計算得到的粒徑約為60 nm[27]； TEM表征下pinSHINs的粒徑約為55 nm； HRTEM表征下其Au核外包裹了約為1 nm的SiO2 殼層，在此厚度下，殼層中分布有大量孔隙[25]，氰根可通過孔隙與Au核表面直接接觸[21]，保持了對氰根響應(yīng)信號的良好增強(qiáng)性能。
3.2 血液氰化物在線裂解吹掃捕集與SERS檢測
目前已報道的氰化物SERS檢測方法中，多存在“溶金”效應(yīng)，檢測信號僅可穩(wěn)定存在5 min[28]； 且目前尚無血液中氰化物的SERS檢測報道。其難點在于，血液中的氰化物大部分與血細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶生成結(jié)合態(tài)[29]，難以直接檢測。構(gòu)建的在線裂解吹掃捕集裝置，以濃H2SO4酸化樣品，可將細(xì)胞中結(jié)合態(tài)氰化物裂解并轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的HCN氣體，經(jīng)N2吹掃至堿液中，形成NaCN，無需任何復(fù)雜反應(yīng)，后續(xù)采用pinSHINs為基底，可對堿性吸收液直接進(jìn)行SERS檢測，即可得到靈敏且穩(wěn)定的氰根指紋譜信號（圖3A）。
經(jīng)優(yōu)化后確定，濃H2SO4濃度12 mol/L、NaOH吸收液濃度0.1 mol/L、N2吹掃時間20 min為結(jié)合態(tài)氰化物裂解捕集最佳條件。將本方法與本課題組已報道的氰化物在線氫化產(chǎn)氣吹掃方法進(jìn)行比較[19]，捕集效率提高了10倍（約為77%～81%）（圖3B）。
不同濃度NaCN（100～2000 μg/L）染毒全血實驗結(jié)果表明，2135 cm處SERS峰強(qiáng)度與NaCN濃度存在良好線性響應(yīng)（y=17x+4393； R2=0.997）（圖4A），定量下限低于臨床上發(fā)生中毒反應(yīng)時血液氰化物濃度（200 μg/L）[9]。低、中、高濃度（200、1000和1500 μg/L）下，本方法相對回收率為91%、106%和108%，RSD值為4.9%、7.6%和4.8%，表明方法可靠性和穩(wěn)定性較好。本方法的檢出限為10 μg/L，低于人血液氰化物致死濃度（LD100）1000 μg/L[27]兩個數(shù)量級，即可檢測到0.01 LD100，適合于檢測各種程度的氰化物中毒血液樣品。
常用的AuNPs易與氰化物發(fā)生“溶金”效應(yīng)，且在強(qiáng)堿性條件下會過度團(tuán)聚，導(dǎo)致檢測信號迅速衰減，而pinSHINs由于其外層包裹的SiO2殼層，有效削弱了“溶金”效應(yīng)，且能耐受較寬的pH范圍，因此穩(wěn)定性得到了有效改善，SERS檢測信號1 h后依然可保持80%以上，如圖4B所示。5個批次pinSHINs的穩(wěn)定性采用低、中、高（200、1000和1500 μg/L）3個濃度NaCN加標(biāo)全血樣品進(jìn)行評估，氰根信號強(qiáng)度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為 6.2%、8.1%和7.7%，表明制備的pinSHINs具有良好的重復(fù)性。
3.3 染毒大鼠全血及臨床樣品氰化物濃度的檢測應(yīng)用實例
利用本方法檢測了50% LD50的NaCN灌胃染毒大鼠不同時間點的全血樣品中氰化物濃度。如圖5A所示， NaCN灌胃10 min后，全血氰化物濃度迅速增加至最大值（2613 μg/L），血液中氰化物半衰期為56 min，與文獻(xiàn)＼[24＼]報道基本相符； 10～30 min氰化物在體內(nèi)的代謝迅速下降； 30～100 min氰化物代謝緩慢降低； 6 h后，氰化物濃度趨于本底值。未染毒大鼠全血中檢測到少量內(nèi)源性氰化物（經(jīng)濃縮富集估算約30 μg/L），可通過隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線排除其干擾。
將本方法用于臨床快速篩查氰化物中毒。分析了3份氰化物中毒患者全血樣品，一份為口服KAl（CN）4藥片39 h后的采集血樣（1#），另兩份為注射網(wǎng)購含氰化鉀或氯化琥珀膽堿的“捕狗藥”后的采集血樣（2#，3#），患者送醫(yī)時均深度昏迷，多臟器功能損傷，嚴(yán)重者呼吸心跳已經(jīng)停止。按照本方法進(jìn)行測定，1#和2#測得氰化物的濃度分別為910和530 μg/L，3#未檢出氰化物（考慮為氯化琥珀膽堿）（圖5B）。 為臨床及時救治提供了參考。
4 結(jié) 論
基于殼層隔絕納米粒子的強(qiáng)堿耐受性和能夠有效克服“溶金”效應(yīng)的優(yōu)勢，以及所構(gòu)建的在線裂解吹掃捕集裝置，建立了一種氰化物快速檢測SERS新方法，實現(xiàn)中毒全血結(jié)合態(tài)氰化物的有效解離、揮發(fā)及吸收，達(dá)到了快速、高靈敏定量檢測中毒血液中氰化物的目的。本方法已應(yīng)用于氰化物灌胃染毒大鼠及臨床氰化物中毒血液樣本檢測，且所有SERS檢測均于便攜式拉曼光譜儀上完成，顯示出在氰化物中毒現(xiàn)場快速檢測良好的應(yīng)用前景。預(yù)期除血液樣品外，本方法亦可適用于食品、環(huán)境復(fù)雜基質(zhì)中的氰化物檢測。
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就電影市場而言，近段時間有部很紅的作品叫做《北京遇上西雅圖》。影片里的女主角文佳佳因為一部電影《西雅圖夜未眠》而來到自己向往的城市西雅圖待產(chǎn)，從而發(fā)生一系列的故事。都說故事源于生活，現(xiàn)實生活中，像文佳佳這樣因為一部電影就只身到異國他鄉(xiāng)的境遇也不在少數(shù)，且不只有小人物，國內(nèi)很多已經(jīng)成名的電影大腕，他們都愿意從代表著中國電影產(chǎn)業(yè)的橫店，飛往心目中向往的電影圣地好萊塢，哪怕只是演個小角色，哪怕露臉很短暫，哪怕播出時發(fā)現(xiàn)刪減版里沒有自己了――也同樣能告訴自己，沒關(guān)系，我最初的夢想只是想來打個醬油而已。
那些散落在外的“國產(chǎn)醬油瓶”
李冰冰 《生化危機(jī)5：懲罰》
角色：艾達(dá)?王
《生化危機(jī)》的角色分化很兩級，要么就是美女，要么就是喪尸。李冰冰這次出演了片中的旗袍女王艾達(dá)?王，無疑是個美女，跟游戲角色的還原度也很高，可是在一個早就被女主角米拉?喬沃維奇統(tǒng)治的系列中，李冰冰只在開頭打喪尸的部分秀了一下花拳繡腿，最終難免淪為跟班。不過李冰冰的團(tuán)隊一直宣稱著自己的重要性，侃侃而談好萊塢的工作團(tuán)隊如何為冰冰量身定做戲服、如何定制假發(fā)，簡言之就是好萊塢很重視她。
周迅 《云圖》
角色：酒店男經(jīng)理、尤娜939、羅斯
前段時間有個很火的手機(jī)游戲叫“找你妹”，那么對于中國觀眾，《云圖》這部大牌云集的科幻大作在看不太懂之余，最能引發(fā)他們興趣的一個游戲就叫做“找周迅”。在影片中，周迅一人分飾三個不同時空不同類型的角色，飾演一個男人、一個女人、一個克隆人，盡管全部是顛覆性的造型，身邊站的也都是漢克斯這樣的大牌，但可惜的是每個角色都仍是標(biāo)準(zhǔn)龍?zhí)住?/p>
許晴 《環(huán)形使者》
角色：老布的女友
在《環(huán)形使者》里，許晴分到了不少動作戲――除了跟老布的感情戲，還大發(fā)脾氣摔東西……她在這部英語片的預(yù)告片中說了一句地道的中文普通話，只可惜從表情到念白到動作，就像在演《雷雨》之類的話劇，強(qiáng)烈的戲劇腔與老外的自然風(fēng)反差明顯。到在內(nèi)地上映的時候，我們還可以看到她5分鐘的戲份，還有臺詞；而在北美版，許晴的臺詞干脆全部被刪掉。
李小璐 《異能》
角色：有預(yù)見未來能力的女孩
就國內(nèi)觀眾而言，李小璐的形象是個清純、任性、受氣包的小媳婦形象。但是到了好萊塢，她成了一個走陰險路線的大反派，以往甜美的笑容換成了努力地扭曲面部肌肉，未免顯得過于猙獰。在《異能》里，李小璐說了兩種語言――英語和粵語，就是沒有普通話，看得人憋屈死了。不過在與達(dá)寇塔?范寧的對戲中我們終于可以確定一件事，就是李小璐的眼睛更大。
黃圣依 《巫山歷險記》
角色：COSPLAY女孩
出現(xiàn)在一部智商6歲的兒童片里不算什么，只是來打個醬油也不算什么，但是在《巫山歷險記》里露了一下臉的黃圣依，短短5秒的出場時間恐怕還不夠化妝費得勁多：白色假發(fā)、銀色胸罩、別著一把寶劍……十足的非主流扮相，目送女主角出電梯，嘴巴微張，好像要說點什么，但最終什么也沒說，于是，這個醬油瓶真的就華麗麗地被觀眾無視了。
李連杰 《敢死隊2》
角色：陰陽
在《敢死隊》第一集就一直叨叨著想要退休的“陰陽”李，終于在《敢死隊2》里達(dá)成心愿，被編劇在10分鐘內(nèi)寫出局，成功辦了“內(nèi)退”。不過看得出來，史泰龍對咱們這位動作明星很是厚道，在他瀟灑展示完招牌的中國功夫后，安排他跳傘回到了祖國的懷抱――這無論是比坐飛機(jī)還是坐高鐵，都要快得多啊。
陳冠希 《蝙蝠俠：黑暗騎士》
角色：接機(jī)男
傳說冠希哥是因為英文極佳才可以出演《黑暗騎士》，可惜導(dǎo)演分給他的臺詞簡單得就像初一英語課本里李雷問候韓梅梅“How are you？”“Fine，Thank You，And you？”一樣簡單，讓人大跌眼鏡，淪為“男花瓶”。
周潤發(fā) 《加勒比海盜3》
角色：海盜邵峰
這個系列一直有糟蹋演員的臭名聲，發(fā)哥也不幸中槍，化了個好像被燙傷的臉妝，留著八字胡，慈禧老佛爺?shù)拈L指甲，除了一拳打斷萬人迷德普的鼻子，其余時間都在凹造型。而且，影片中的發(fā)哥好像嫌自己還不夠高大，一定要仰著頭說臺詞，以表現(xiàn)角色的趾高氣揚，就像費玉清在唱歌。可惜遇上不解風(fēng)情的廣電總局，把發(fā)哥在開場的表演給刪光了。
大明星為何熱衷西游“打醬油”
也許是因為語言畢竟不同，也許是因為好萊塢對中國影星的印象還僅僅停留在“中國功夫”，即使在國內(nèi)再大牌的“腕兒”，到了好萊塢都難免淪為龍?zhí)?、跟班、醬油瓶。可為什么即便如此，還是有一眾明星擠破了頭也想去好萊塢“西游”一圈呢？
首先，作為一個龐大的電影城，好萊塢早就無形中成為美國電影，甚至是全球音樂電影產(chǎn)業(yè)中心地帶的代名詞，這里的時尚與科技互相牽制發(fā)展，是不造作的，擁有著深厚的時尚底蘊和雄壯的科技做支持，一直被全球各地爭相模仿，自然也是眾家明星向往之地。
其次，好萊塢影片的劇本和當(dāng)中精彩的元素都吸引著演員去挑戰(zhàn)。就像周迅解讀自己參演《云圖》的意圖時曾說：“參演這個電影是因為我對角色和故事很感興趣，我也喜歡做一些有挑戰(zhàn)性的工作。”
除了榮耀之外，對于明星們而言，能在一部全球放映的好萊塢電影中有良好的表現(xiàn)，就意味著有更多宣傳自己的機(jī)會，名氣擴(kuò)大，甚至?xí)虼私拥礁嗟拇?。一般女星的?jīng)紀(jì)方都會跟好萊塢片方商量，是否能讓這個女星領(lǐng)銜該片在亞洲地區(qū)的宣傳。這種事既賺面子又賺錢，當(dāng)然要盡力爭取。
好萊塢為何需要中國“醬油瓶”
而作為好萊塢方面，為什么也樂意敞開胸懷，頻頻接受大批中國明星前來“打醬油”呢？在《生化危機(jī)5》宣傳時，作為走進(jìn)好萊塢的中國女星之一，李冰冰方面也表示，“中國火熱的電影市場確實吸引了很多制片商，中國元素也成為他們選擇的一個因素?！碑?dāng)越來越多的中國明星亮相好萊塢電影，就意味著好萊塢影片更容易進(jìn)入中國市場。而中國票房不斷走高，市場看好，好萊塢自然不會漠視。
還有一種觀點，就是認(rèn)為好萊塢影片加入大量的中國元素，實際上是在鉆“合拍片”的空子。國家廣電總局副局長張丕民就在央視電影頻道舉辦的研討會上，提出今后要嚴(yán)格審查中美合拍片。原來，繼去年廣電總局出臺了限制“美國大片”播出時間和分成的一系列政策后，一些進(jìn)口大片因為加入了中國元素，便借此以“合拍”標(biāo)簽躲過政策。張丕民說，“投點小錢，甚至有的連錢都不投，一個美國故事加上點中國元素，帶上一個中國演員，這就叫合拍片了，這是非?？膳碌?。還理所當(dāng)然以中國影片的身份在最好的檔期占了最長的時間?！辈贿^，這種觀點未免有些小人之心度君子之腹，畢竟，能看到國內(nèi)的明星大腕兒們走進(jìn)好萊塢，也是一種中國式驕傲。
橫店遇上好萊塢