代寫情書精選(九篇)

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第1篇：代寫情書范文

摘要：總體看來，研究者對浪漫抒情小說在20－40年代流變的梳理顯得相對較少，其中有許多的問題需要繼續(xù)探討，比如浪漫主義小說為何在20年代走上全盛，在不同的年代各自有什么特點，這些問題都亟待解決。本文試圖從橫縱坐標圖中梳理出浪漫抒情小說的特點，窺視其創(chuàng)作流變過程。一方面，從橫向看，浪漫抒情小說的共同的特點，使其成為獨立的存在?？v向看，在不同時展也顯現(xiàn)出與其他流派的不同特點；另一方面，橫向軸上不同題材的浪漫抒情小說之間也存在著異同，這也需要在時間的縱軸上仔細分析，以便把握它們的發(fā)展脈絡(luò)。

關(guān)鍵詞：浪漫抒情小說；自我；田園

一方面，從橫向看，浪漫抒情小說有許多獨特的創(chuàng)作方法及其他共同的特點，這使我們將它們歸結(jié)為浪漫抒情小說這一派別，從而區(qū)別于其他流派，成為獨立的存在。最明顯的是區(qū)別于現(xiàn)實主義小說的提出社會問題激發(fā)思考，客觀敘述、典型塑造及布局嚴謹，浪漫主義的風(fēng)格特征是“自我小說”(1)、感傷抒情、體式的散文化及詩化，尤其“在我國小說的體式發(fā)展上具有極大的新鮮性”(2)。縱向看，浪漫抒情小說在不同時展中顯現(xiàn)出與其他流派的不同特點；另一方面，橫向軸上不同題材的浪漫抒情小說之間也存在著異同，這些不同則反映了浪漫抒情小說自身的復(fù)雜多變性，這些不同，同樣需要我們在時間的縱軸上仔細分析，以便把握它們的發(fā)展脈絡(luò)。本文以浪漫抒情小說題材中比較具有代表性的自我和田園浪漫抒情小說為例，時間上劃分為20年代前中期上延至清末民初、20年代末至30年、40年代三個階段，嘗試著從橫縱坐標圖中梳理出浪漫抒情小說的特點，窺視其創(chuàng)作流變過程。

一、自我的浪漫抒情小說在20－40年代的新陳代謝

20年代前中期上延至清末民初的感傷的浪漫抒情小說，要求個性解放尊崇自我價值而又遭到社會壓抑的年輕一代，在本國文學(xué)承傳和外國抒情文學(xué)的雙重影響下，用寫作表達內(nèi)心激情，形成了獨特風(fēng)格。1、20世紀初西方世紀末文學(xué)思潮影響下自我的浪漫抒情小說形成了感傷、憂郁、頹廢的特點。比如郁達夫的《沉淪》；2、俄國多余人形象，這是俄國世紀末情緒的體現(xiàn)，在其影響下我國浪漫抒情小說也帶有零余者的特點。比如郁達夫、郭沫若筆下的主人公，多是多余人；3、日本私小說的自然主義式的自我袒露結(jié)合世紀末情緒和多余人氣質(zhì)，在此風(fēng)籠罩下的中國自我浪漫抒情小說演化為感傷的自敘心理傾訴，常用日記體、書信體。這在郁達夫、郭沫若和其他創(chuàng)造社作家中有明顯都體現(xiàn)；4、中國古代文學(xué)感傷傳統(tǒng)和中國文人固有的抒情氣質(zhì)影響此時的中國自我浪漫抒情小說，表現(xiàn)為常從古代文學(xué)中取材與意境。比如倪貽德《花影》、郭沫若《行路難》分別取意境于李后主的詞和李白的詩；5、加之封建王朝瀕臨末世使得20年代前中期上延至清末民初的自我浪漫抒情小說有著悲涼感傷情調(diào)。比如蘇曼殊《斷鴻零雁記》。(3)種種因素最終促成20年代個人浪漫抒情小說走向全盛。創(chuàng)造社的、淺草一沉鐘社的陳翔鶴、林如稷等“藝術(shù)派”作家為浪漫主義抒情小說創(chuàng)作的主干；甚至少數(shù)文學(xué)研究會的作家也不乏浪漫抒情小說的創(chuàng)作，如廬隱《海濱故人》王以仁的《孤雁》；還有新潮社時期的羅家倫。

20年代末至30年代堅守自我的作家也不少，浪漫抒情小說仍然綿延不絕。這一時期的自我的浪漫抒情小說與前一個時期相比有許多異同。相同之處在于1、即使在30年代革命文學(xué)和普羅文學(xué)創(chuàng)作中，走向左翼，走向健康熱烈積極向上時，作家的自我情感也還是無法徹底回避的因素，感傷色調(diào)依然時隱時現(xiàn)。并在一定意義上反映著世紀末的某種病態(tài)。2、這一時代的感傷較之20年代的來自于作家對時代社會極不適應(yīng)的過敏反應(yīng)，仍舊比較明顯的反應(yīng)在30年代，這體現(xiàn)了20到30年代的傳承關(guān)系。這在丁玲的《沙菲女士的日記》和柔石的《二月》上有明顯的體現(xiàn)。3、30年代作家筆下具有20年代浪漫抒情氣質(zhì)的形象不勝枚舉；主要的不同：20年代末至30年代初，由于時代風(fēng)云的變幻，許多作家逐步轉(zhuǎn)向，紛紛從小我走向社會這個大我，浪漫抒情小說面臨被檢討、批判、否定的命運。20年代感傷的集中、典型，在30年代自我浪漫抒情小說在時代因素影響下走向淡化，形成逐步斂縮的局面。20年代末至30年代的自我的浪漫抒情小說更有自己的特色，作家像悖時的文人發(fā)出的病態(tài)。

30年代至40年代經(jīng)過戰(zhàn)火的磨煉，文學(xué)史上堅守自我的作家仍占相當?shù)谋戎?。他們中的不少人對于浪漫抒情依然持有濃厚的興趣，40年代的自我的浪漫抒情小說雖然斂縮，但注定不斷延續(xù)?？偺攸c是理性主義的發(fā)達。如在中國的現(xiàn)代派作家的筆下，雖主要反映現(xiàn)代性，但倒是充滿浪漫抒情情調(diào)。如無名氏《塔里的女人》、《北極風(fēng)情畫》，這些小說中有些情節(jié)場景也寫得很感傷，有五四式感傷氣質(zhì)，有浪漫抒情的情調(diào)。

二、田園的浪漫抒情小說在20－40年代的新陳代謝

田園浪漫抒情小說(包括鄉(xiāng)野浪漫抒情小說)，這一類型的小說與鄉(xiāng)土文學(xué)有著明顯的相似及不同之處。兩者聯(lián)系密切，糾纏發(fā)展，因而鄉(xiāng)土寫實常常與田園浪漫抒情小說相混淆，這需要我們認真的理清它們之間的區(qū)別之處。

20年代前中期魯迅的作品《故鄉(xiāng)》傳達出的實際上就是浪漫的自然和自然人的觀念。許欽文前期的寫作實際上是他開手寫鄉(xiāng)土文學(xué)前，在尋找一種精神家園，他們都為田園浪漫抒情小說奠定了基礎(chǔ)。他們的作品類似于鄉(xiāng)土文學(xué)，注重真，而其中美和善卻缺失。正式開啟田園浪漫抒情小說的是處在20年代的廢名，他的田園浪漫抒情小說明顯突出特征是憂傷與玄。另外的如郁達夫的《沉淪》，也有對自然的溢美之詞。

30年代鄉(xiāng)土文學(xué)中因傳達這種流行著的、感傷的懷鄉(xiāng)病而體現(xiàn)浪漫抒情風(fēng)格，但同時顯示出異色。20年代的鄉(xiāng)土文學(xué)基本上是現(xiàn)實主義風(fēng)格，30年代所寫的田園抒情小說以現(xiàn)代文明的弊端為參照來反觀心目中遙遠的鄉(xiāng)村，常帶有一種主觀的理想的色彩，比如廢名、沈從文，他們是對田園浪漫抒情繼續(xù)與開拓。帶著優(yōu)美、健康而理想的人生設(shè)計特點的田園浪漫抒情小說。人們誤把“他們筆下的風(fēng)情畫面都被當成了鄉(xiāng)土寫實的緣故?！?4)所以把他們當做鄉(xiāng)土寫實的作家來看待，他們實際是浪漫抒情小說發(fā)展的新的階段。在30年代中期達到頂峰，但同時也意味著走向衰退。20年代沒有家園，逃離家園，出去流浪，30年代回到家鄉(xiāng)，尋找失落的家園。小說家們找回了過去的夢，但發(fā)現(xiàn)這時的家園已經(jīng)不是自己心目中的理想的家園。夢想已經(jīng)破滅，這是更進一步的精神家園的失落。這兩個時代共同之處是作家所刻畫的人物一般都經(jīng)歷著漂泊、尋找、失落三部曲。

40年代的汪曾祺繼承接續(xù)、豐富和擴展田園浪漫抒情小說。后來他又創(chuàng)了尋根小說的先聲。

第2篇：代寫情書范文

l材料與方法

1．1實驗場地選擇

2010年7月一2010年11月，在廣東省汕尾市紅海灣鴻泰養(yǎng)殖場，從10口凡納濱對蝦高位精養(yǎng)池塘中隨機抽取6口池塘進行采樣。各池塘面積約為(0．45土0．1)hm2。池底鋪設(shè)土工膜，無泥沙層，水深1．8～2．2m，養(yǎng)殖用海水經(jīng)沙濾井過濾所得。每口池塘配備12～15kw／hm2的增氧設(shè)備(增氧機和底部增氧曝氣管)。放養(yǎng)凡納濱對蝦∞f^妒e刀口P螂1，口刀，z口mef)蝦苗體長(1．0士0．1)cm，放苗量為270萬尾／h“。

1．2材料及方法

1．2．1樣品采集采樣時間和頻率按照養(yǎng)殖時間劃分。在第一批放苗的五口池塘中隨機選取卜3號3口池塘。從放苗日起，跟蹤其養(yǎng)殖全程，時間從2010年7月31日到同年11月24日，約14d取一次樣，跟蹤時長116d。根據(jù)第一批的調(diào)查結(jié)果，在第二批放苗的5口池塘中隨機選取4—6號3口池塘從放苗后的第10天起，進行養(yǎng)殖密集采樣跟蹤，時間從2010年9月18日到同年11月20日，采樣時間為7天1次，跟蹤時長63d。第二批采樣池塘均因wSS暴發(fā)而中斷養(yǎng)殖。所取蝦樣均為活蝦，每次每塘隨機采集對蝦不少于15尾，分別采集對蝦的鰓和肌肉組織，用濃度為75％的酒精固定。

1．2．2DNA的提取將每次采集的15尾對蝦隨機分成3組，每組5尾。任選一組，并分別取5尾蝦的鰓或者肌肉組織混合成一個樣品，鰓組織樣品總質(zhì)量為(15士2)mg，肌肉組織樣品總克數(shù)為(20土3)mg。各組織樣品DNA采用“天根海洋動物組織DNA提取試劑盒”(天根生物技術(shù)有限公司制造)提取。所提取的DNA樣于一20℃保存待測。

1．2．3Real．timePCR引物和探針引物和探針的選擇。根據(jù)DurandandLi曲tner【6J設(shè)計，由Invitrogen公司合成(表1)

1．2．4Real．timePcR反應(yīng)參照Li曲tIler等舊1建立的實時熒光定量PcR法檢測wSsV使用Eppendorf熒光定量PCR儀(EppendorfMastercy-clerRealplex)進行定量PcR檢測。選取20“LPcR反應(yīng)體系：1O燦2xTaqManUniversalPCRMasterMix(TAKARA公司，代號DRR039A)，上下游引物各0．5燦(終濃度為10“m01／L)，探針0．5皿(終濃度為5“mol／L)，模板DNA2此，補充水至20此。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃30s；95℃5s，55℃15s，72℃30s，40個循環(huán)，每個樣品重復(fù)4次，每批樣品設(shè)置空白對照和陽性對照?？瞻讓φ沼脺缇兯髂０?，陽性對照用已知病原蝦提取的DNA調(diào)整濃度后作模板。

1．2．5標準品的制備和標準曲線的建立陽性質(zhì)粒標準品制備根據(jù)Lightner[6]利用插入外源目的基因的方法得到純化陽性質(zhì)粒DNA，其濃度為1．618×108copy／此。用10倍稀釋陽性質(zhì)粒至7個梯度作模板并對其進行擴增，其平均CT值依次為34．90、31．04、27．65、24．57、20．24、17．11、13．66，標準曲線如圖l所示，R2=0．9991。

2結(jié)果與分析

2．1第一批放苗1～4池塘養(yǎng)殖全程對蝦攜帶wSSv檢測結(jié)果

2．1．114—34池塘對蝦鰓組織中WSSV攜帶量在養(yǎng)殖全程中，14—3”池塘對蝦鰓組織中wsSV攜帶量的動態(tài)變化如圖2所示。從圖中可以看出，3口池塘的對蝦苗種均攜帶wssv，且其攜帶量均達到了103copy幢以上。隨著養(yǎng)殖的進行，對蝦鰓組織中wssV的攜帶量整體呈現(xiàn)波動上升的趨勢。養(yǎng)殖前期上升幅度較小，最高攜帶量為1．o×105copy幢；到養(yǎng)殖60d左右，24、34池塘出現(xiàn)第一個波動高峰，此時鰓中wssV攜帶量最高可達到3．O×107c叩y／g。隨后其病毒攜帶量有所下降；到養(yǎng)殖后期，1”一3“池塘的wssv攜帶量均有較大幅度的上升，均在養(yǎng)殖末期達到最大峰值。養(yǎng)殖全程中，14池對蝦鰓組織wssv攜帶量的波動范圍為1．6×103—8．6×106c叩y恒，平均值1．1×106cdpy／g；2”池對蝦鰓組織wssV攜帶量的波動范圍為1．9×10’~2．1×107c叩y儋，平均值4．4×106copy悖；34池對蝦鰓組織wssv攜帶量的波動范圍為6．2×103～9．7×108copy／g，平均值1．1×108copy／g。

2．1．21L3”池塘對蝦肌肉組織中wsSv攜帶量在養(yǎng)殖全程中，1群一3j!j}池塘對蝦肌肉組織中wssV攜帶量如圖1所示，其動態(tài)變化情況與鰓組織中的趨勢相似，均呈現(xiàn)波動上升的趨勢，但整體低于鰓組織。結(jié)果顯示，14養(yǎng)殖池對蝦肌肉組織wssV攜帶量的波動范圍為1．3×103～4．4×105copy／g，平均值3．2×105copy／g；24養(yǎng)殖池對蝦肌肉組織wssV攜帶量的波動范圍為2．1×103～6．1×105copy／g，平均值2．8×105copy／g；34養(yǎng)殖池對蝦肌肉組織WssV攜帶量的波動范圍為6．5x103～1．1×106copy／g，平均值3．3×105copy／g。1虻38池塘病毒含量(取對蝦鰓和肌肉組織帶毒量的平均值)，環(huán)境指標及養(yǎng)殖環(huán)境狀況見表2。

2．2第二批放苗4L64池塘加密采樣對蝦攜帶WSSv的檢測結(jié)果

2．2．14牝礦池塘對蝦鰓組織wSSV攜帶量44—6“池塘對蝦鰓組織WSSv攜帶量在養(yǎng)殖過程中的動態(tài)變化如圖2所示。從圖中可以看出，前期病毒攜帶量均較低，隨著養(yǎng)殖的進行，3個池塘對蝦鰓組織中wssv攜帶量逐漸升高，30d左右各池出現(xiàn)第一個波動高峰，wssV最高攜帶量為1．21×106copy／g，隨后有所穩(wěn)定和下降，但11月6日即養(yǎng)殖53d后，攜帶量快速增長。其中58池塘攜帶量在5天之內(nèi)從2．3×105copy儋升高至8．2×1010copy／g，最終暴發(fā)wss，導(dǎo)致中斷養(yǎng)殖，最后一次采樣缺失：44、64池對蝦wSSV攜帶量在后兩次采樣中迅速增加，最后一次采樣11月20日(即養(yǎng)殖63d)時均達到各池檢測的最大值(分別為6×106copy／g和5×107c叩y／g)，雖未達到發(fā)病閾值但兩池最終也因暴發(fā)wsS而于11月27—30日停止養(yǎng)殖。調(diào)查結(jié)果顯示，在整個養(yǎng)殖過程中，48池對蝦鰓組織wssv攜帶量的波動范圍為8．1×103～6×106copy／g，平均值8．6×105copy／g；5“養(yǎng)殖池對蝦鰓組織wSsV攜帶量的波動范圍為1．7×104～8．2×1010copy／g，平均值7．0×109copy／g；6”養(yǎng)殖池對蝦鰓組織wSsv攜帶量的波動范圍為5．7×103～5．0×107copy／g，平均值4．3×106copy／g。

2．2．24L6”池塘對蝦肌肉組織中WSSV攜帶量44—64池塘對蝦肌肉組織wSSv攜帶量在養(yǎng)殖過程中的動態(tài)變化如圖2所示，其變化情況與鰓組織的趨勢相似，均隨養(yǎng)殖時間的進行逐漸波動上升，且無顯著性差異。調(diào)查結(jié)果顯示，4”池對蝦肌肉組織WSSV攜帶量的波動范圍為8．1×103～9．4×107copy／g，平均值1．1×1017copy／g；5“池對蝦肌肉組織wSsV攜帶量的波動范圍為1．7×104～1．2×1010copy／g，平均值1．1×109copy／g；6”池對蝦肌肉組織wSSv攜帶量的波動范圍為5．7×103～5．5×105copy／g，平均值1．1×10’copy／g。4牝64池塘病毒含量(取對蝦鰓與肌肉組織帶毒量的平均值)，環(huán)境指標及養(yǎng)殖環(huán)境狀況見表3。3討論TaqMan探針法熒光定量PcR是實時熒光定量PCR(Real．timePCR)的一種，可以針對微量的病毒進行檢測并實時監(jiān)測病毒的復(fù)制情況，其特異性更強，準確度更高，被廣泛用于微量病毒復(fù)制的定量研究[7]。本研究采取實時定量PcR—TaqMan探針法，對高密度精養(yǎng)池塘對蝦wssV攜帶量進行跟蹤調(diào)查，以期能夠更加準確的了解對蝦養(yǎng)殖過程中體內(nèi)wssv攜帶量的變化。本次檢測結(jié)果表明，被測對蝦苗種攜帶微量wSSV范圍在1．3×103～1．7×104copy儋。蝦苗攜帶病原體，說明了苗種生產(chǎn)過程中的病害控制還需加強，對育苗場銷售的苗種病害監(jiān)控還需嚴格【8J。整個檢測結(jié)果表明，對蝦鰓組織中的wssV攜帶量整體多于肌肉組織，且兩者變動趨勢一致，但沒有顯著性差異(尸>0．05)。在對14—3“池塘整個養(yǎng)殖過程的調(diào)查中，wssV攜帶量在養(yǎng)殖前期(47d前)都有不同程度的增加，但均處于一個較穩(wěn)定的水平，wsSV拷貝數(shù)總體保持在104copy／g左右，個別值高于105copy／g；養(yǎng)殖中后期(60～116d)攜帶量呈現(xiàn)波動上升的趨勢，并在最后一次采樣中達到相對最大值。根據(jù)1“一34池塘中對蝦體內(nèi)wssv前期攜帶情況的調(diào)查，對第二批采樣的4虻64號3口池塘進行密集采樣，縮短了采樣時間，增加了采樣次數(shù)，以期更好的反應(yīng)wssv的變化規(guī)律及其受各種環(huán)境因素影響所表現(xiàn)出的動態(tài)變化。在對4牝64池塘養(yǎng)殖的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，這3口池塘對蝦攜帶wssV的情況與1L38池塘較為相似，前期病毒含量有一定程度的上升，但均處于一個較穩(wěn)定的水平，除個別池塘外，wssv拷貝數(shù)多保持在105copy／g以下。然而53d后急劇上升，其中5”池塘升高至109copy／g以上，導(dǎo)致wSS暴發(fā)。44和64池塘也緊急收獲，致使養(yǎng)殖中斷。

第3篇：代寫情書范文

關(guān)鍵詞：常熟市；代謝綜合征；調(diào)查

隨著經(jīng)濟高速發(fā)展，生活方式的巨大改變，人群中肥胖、血脂異常、高血壓病、糖尿病的患病率明顯升高[1]。代謝綜合征（MS）是多種代謝成分異常聚集的病理狀態(tài)，發(fā)病率快速增長，其后果為冠心病、動脈粥樣硬化、糖尿病，成為我國重要的公共衛(wèi)生問題[2]。許多大城市相繼開展流行病調(diào)查工作，為了了解我市農(nóng)村社區(qū)的發(fā)病情況，于2013年對昆承湖社區(qū)進行調(diào)查分析，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 昆承湖社區(qū)有兩個行政村合并而成，常住居民1830人，其中40以上居民有1209人，針對上述居民采取結(jié)合65歲以上老年人健康體檢、50歲以上社保退休職工體檢，及抽樣體檢的方法，實際檢查1148人，其中男性591人，女性617人。

1.2方法

1.2.1問卷調(diào)查 采用自行設(shè)計的調(diào)查問卷，對1148例抽檢人員的基本情況進行調(diào)查分析，內(nèi)容主要包括人口學(xué)信息、代謝異常病史、慢性病家族史、飲食習(xí)慣、有無吸煙、飲酒習(xí)慣、體力情況等資料。由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的相關(guān)成員擔(dān)任本次研究的調(diào)查員，將問卷于社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心發(fā)放，對抽檢人員的相關(guān)情況進行詢問，并詳細填寫問卷，并由調(diào)查員當場收回。

1.2.2人體學(xué)指標測量 由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的醫(yī)務(wù)人員對1148例抽檢人員的人體學(xué)指標進行測量，主要指標包括身高、體重、腰圍、臀圍、舒張壓、收縮壓、握力、視力、脈搏、聽力、眼底檢查、牙齒脫落情況以及5s起坐時間等。

1.2.3生化指標測量 集中分次，統(tǒng)一標準，對1148例抽檢人員的生化指標進行測量，采集空腹靜脈血，并低溫保存，當日送至醫(yī)院，并用日立全自動生化儀采取葡萄糖氧化酶法對其FPG（空腹血糖）、2hPG（餐后2h血糖）、TG（甘油三酯）與TC（總膽固醇）進行檢測，同時對其LDL-C（低密度脂蛋白膽固醇，采取Friedewald等式計算）、HDL-C（高密度脂蛋白膽固醇，采取直接法）以及UA（尿酸，采取尿酸酶-POD法）等各項指標進行檢測。

1.3診斷標準 中心性肥胖：男性腰圍≥90cm，女性腰圍≥80cm，另加下列4因素中任意兩項：①甘油三酯水平升高：>150mg/dl（1.7mmol/L），或已接受針對此脂質(zhì)異常的特殊治療；②高密度脂蛋白膽固醇水平降低：男性

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0系統(tǒng)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，其中計量資料采用（x±s）表示，并應(yīng)用t檢驗；計數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗；且P

2 結(jié)果

2.1社區(qū)居民各年齡段發(fā)病情況 社區(qū)40歲以上人群中高血壓、超重/肥胖、高血糖及血脂異常的發(fā)病率分別為20.3%、14.1%、6.0%、35.6%。其中40-50歲的患病率為9.7%，51～60歲的患病率為19.0%，60歲以上的患病率為22.9%。經(jīng)χ2檢驗，40～50歲年齡段的發(fā)病率明顯低于50～60歲、60歲以上年齡段人群的發(fā)病率，差異顯著（P

2.2農(nóng)村社區(qū)與通州城區(qū)MS發(fā)病率對比 農(nóng)村社區(qū)MS發(fā)病例，發(fā)病率為17.0%；通州城區(qū)MS發(fā)病例，發(fā)病率為32.6%。在MS發(fā)病率上，農(nóng)村社區(qū)明顯低于通州市城區(qū)，差異明顯（P

3 討論

代謝綜合征是多種代謝異常情形集結(jié)存在，包括糖尿病，或糖調(diào)節(jié)受損、高血壓、血脂異常、肥胖、高胰島素血癥伴胰島素抵抗，是引起心腦血管疾病的高危因素和導(dǎo)致人類致死、致殘的主要原因之一[4-5]。隨著社會的發(fā)展，社區(qū)居民的生活方式發(fā)生了明顯改變，代謝綜合征患病率日趨上升，初步統(tǒng)計我國MS患病率已達14%～18%。在人群中早期篩查并發(fā)現(xiàn)代謝綜合征的高危人群，及時早期干預(yù)和預(yù)防，有重要意義。另外，對代謝綜合征的防治應(yīng)采取以改善胰島素抵抗為基礎(chǔ)的全面防治心腦血管危險因素的綜合干預(yù)措施，大力宣傳"合理膳食、適量運動、戒煙限酒、心里平衡"十六字健康方式，在社區(qū)積極開展以老年人（50、60歲以上）的文化體育活動，以減少靜坐和活動減少帶來的代謝性疾病，從而減少相應(yīng)的并發(fā)癥[6]。

本研究就常熟市社區(qū)1148例40歲以上居民進行調(diào)查研究顯示，我市農(nóng)村社區(qū)患病率達17.0%，明顯低于城區(qū)（32.6%），兩者比較差異顯著（P

參考文獻：

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第4篇：代寫情書范文

【關(guān)鍵詞】  低聚原花青素;1型糖尿病;血脂;胰島素

          心血管并發(fā)癥是糖尿病(diabetes mellitus，dm)的主要并發(fā)癥和致死原因，而脂代謝異常是糖尿病患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的重要危險因素[1]。wWw.133229.Com天然抗氧化劑低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidin，opc) 由于具有降血糖、降血脂及免疫調(diào)節(jié)等作用和高效、低毒、高生物利用率等特點而受到醫(yī)藥界的廣泛重視[2，3]，本文研究opc對1型糖尿病(type1 diabetes mellitus，t1dm)小鼠血脂代謝以及胰島素表達水平的影響，為opc藥物開發(fā)和應(yīng)用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 opc:由葡萄籽和松樹皮經(jīng)紅酒萃取，美國greensboro公司產(chǎn)品;鏈脲佐菌素(streptozotocin，stz)：美國sigma公司;accuchek active型血糖儀及血糖測試條：德國roche診斷有限公司;modular pp全自動生化分析儀及酶法檢測配套試劑盒，包括總膽固醇(tc)檢測試劑盒(chodpap法)、甘油三酯(tg)檢測試劑盒(gpopap法)、高密度脂蛋白膽固醇(hdlc)及低密度脂蛋白膽固醇(ldlc)檢測試劑盒(酶直接法)：德國roche公司;兔抗小鼠胰島素多克隆抗體(antiinsulin)、過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(streptavidin peroxidase，sp)試劑盒：北京博奧森生物技術(shù)有限公司;組織切片機、顯微照相裝置：德國萊卡公司。

1.1.2 動物 健康雄性昆明小鼠60只，體質(zhì)量26～30g，由長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型制作[4，5] 用ph4.4的0.1mol/l枸櫞酸鈉緩沖液新鮮配制stz溶液，按45mg/kg每日給50只小鼠行腹腔注射，連續(xù)5d。注射后小鼠自由飲水、進食標準飼料;每周1次采尾靜脈血測定小鼠全血血糖值，空腹血糖值在12mmol/l以上的小鼠為糖尿病模型。

1.2.2 動物分組與opc給藥 stz末次注射后2周，取40只糖尿病小鼠分為4組，每組10只，每天上午禁食2h后灌胃給藥：①opc低劑量組：opc粉劑溶于蒸餾水按50mg/kg體質(zhì)量給藥;②opc中劑量組：opc 100mg/kg體質(zhì)量;③opc高劑量組：opc 150mg/kg體質(zhì)量;④糖尿病模型對照組和作為⑤組的正常對照小鼠(10只)灌胃等容量蒸餾水。

1.2.3 主要觀測指標 試驗過程中注意觀察動物飲水量、進食量、尿量和體質(zhì)量的變化及糖尿病癥狀表現(xiàn);4周末小鼠空腹摘眼球取血，3000rmp/min離心分離血清，按試劑盒要求操作，檢測血清tc、tg、hdlc、ldlc含量;處死小鼠取胰腺標本，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋切片、脫蠟水化、微波抗原修復(fù)后，按sp試劑盒要求進行免疫組織化學(xué)染色(抗小鼠胰島素抗體工作濃度為1∶300)、dab顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明，中性樹脂封片，最后顯微鏡觀察、拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 計量實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異性檢驗用spss11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。p<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 opc對dm小鼠癥狀的影響 試驗過程中觀察到t1dm模型組多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕等糖尿病癥狀典型并在試驗過程中加重，而opc各組以上癥狀明顯較輕且體質(zhì)量仍有緩慢增加，表明opc具有緩解和改善糖尿病癥狀的作用。

2.2 opc對實驗動物血脂的影響 糖尿病模型組表現(xiàn)為高血脂癥，與正常組相比，血清tc、tg、ldlc顯著增高(p< 0.01，p <0.05)，hdlc降低但不具統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05);與dm組比，opc組血清tc、tg、ldlc降低(p< 0.01，p<0.05)，表明opc主要降低tc、tg、ldlc，并以中、高劑量作用較大，但對hdlc的影響不明顯，見表1。 表1 opc對糖尿病小鼠血脂含量的影響注：與正常對照組比較，*p<0.05，**p<0.01;與模型對照組比較，p<0.01，p<0.01。

2.3 胰腺免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 顯微鏡下可見正常小鼠胰腺組織胰島數(shù)目多，呈圓形或橢圓型，結(jié)構(gòu)完整;t1dm組胰島數(shù)目明顯減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)改變甚至被破壞， 有不同程度的淋巴細胞浸潤。(第89頁彩色圖版ⅰ之)圖1示正常對照組胰島結(jié)構(gòu)完整，胰島細胞呈深棕色，著色部位在胞漿，胰島素高表達;(第89頁彩色圖版ⅰ之)圖2示模型組胰島結(jié)構(gòu)破壞，多量淋巴細胞浸潤，僅少量胰島細胞著色，胰島素表達明顯減少;(第89頁彩色圖版ⅰ之)圖3示opc組，胰島結(jié)構(gòu)相對完整，胰島細胞著色淺但著色細胞明顯多見，淋巴細胞浸潤較少，表明由stz誘導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)有所減輕，胰島素分泌增加。

3 討 論

stz小劑量多次注射stz選擇性破壞動物胰島細胞， 使之釋放自身抗原成分刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身抗體，胰島b細胞進行性損害，胰島素合成受阻、缺乏， 導(dǎo)致自身免疫性1型糖尿病的發(fā)生。而胰島素不足，脂肪組織攝取葡萄糖及從血中移出甘油三酯減少，脂肪合成減少;脂蛋白酯酶活性低下，血游離脂肪酸和甘油三酯濃度升高則引起糖尿病的脂代謝紊亂[6] 。本試驗表明，糖尿病小鼠脂代謝明顯異常，tc、tg和ldlc顯著升高，hdlc也有降低;opc早期用藥能顯著降低糖尿病小鼠血中甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇，改善糖尿病小鼠的脂代謝異常。其作用機理可能是通過對糖尿病小鼠胰島β細胞的修復(fù)作用，促進胰島素分泌功能，從而起到減輕小劑量多次注射stz所誘導(dǎo)的胰島自身免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂代謝和改善癥狀的作用。由于脂代謝紊亂是糖尿病腎病和心血管病等并發(fā)癥的高危因素，糾正糖脂代謝紊亂是減少和治療糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵[1] ，因此opc的以上作用在減少糖尿病并發(fā)癥，尤其是心血管并發(fā)癥方面可能具有重要意義。opc目前主要用于保健品，但其作為降糖[7]、降脂及免疫調(diào)節(jié)的抗氧化藥物用途方面的研究應(yīng)用正在引起關(guān)注。鑒于我國的opc資源豐富，而糖尿病及并發(fā)癥發(fā)生率高，我們的研究對opc的進一步開發(fā)和應(yīng)用于防治糖尿病及其并發(fā)癥方面具有積極作用。

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第5篇：代寫情書范文

[關(guān)鍵詞] 硫化氫；代謝綜合征；血糖；胰島素

[中圖分類號] R589 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2013）12（b）-0000-02

1988年，Reaven首次提出X綜合征又稱為胰島素抵抗綜合征或代謝綜合征（metabolic syndrome，MS），包括胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、高胰島素血癥、脂質(zhì)代謝紊亂以及高血壓等綜合的病理變化[1]。MS是多基因和多種環(huán)境因素綜合作用所致的疾病，患病率逐年上升，已成為當前社會嚴重威脅人民健康的公共衛(wèi)生問題。研究發(fā)現(xiàn)，機體可以內(nèi)源性產(chǎn)生硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）并完成一定的生理功能。生理濃度的H2S與氣體分子一氧化氮、一氧化碳在部分生物學(xué)功能方面相同或相似，因此，它被看作體內(nèi)第三種的氣體信號分子。H2S是以L-半胱氨酸為底物，在胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）的作用下產(chǎn)生，廣泛參與諸多的疾病的發(fā)病與轉(zhuǎn)歸[2]。研究表明，外源性H2S治療可減輕高糖引起的ROS產(chǎn)物的級聯(lián)反應(yīng)，減輕DNA的損傷[3]，外源性H2S能抑制高濃度葡萄糖引起的心肌細胞損傷[4]，可以抑制胰島素分泌和成熟脂肪細胞對葡萄糖的攝取[5]。筆者前期研究工作也發(fā)現(xiàn)，MS小鼠內(nèi)源性H2S/CSE體系受到嚴重抑制，因此推斷H2S參與了MS小鼠血糖和胰島素水平的調(diào)節(jié)。

基于以上問題，本實驗選用KK/Upj-Ay/J小鼠作為MS小鼠動物模型，觀察H2S供體NaHS對血糖和血胰島素水平的影響，以及NaHS對C2C12骨骼肌細胞葡萄糖攝取能力的影響，并通過觀察NaHS對小鼠胰島瘤細胞（NIT-1細胞）胰島素分泌的影響，對機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞

MS模型雄性KK/Upj-Ay/J小鼠（8～10周）由中科院動物所提供（動物質(zhì)量合格證號：SCKK2004-0001）；正常對照雄性C57BL/6J小鼠（8～10周）由中科院動物所提供（動物質(zhì)量合格證號：SCKK2005-0013）；小鼠胰島瘤（NIT-1）細胞由首都醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室贈予；小鼠C2C12骨骼肌細胞株購自上海中科院細胞庫。

1.2 試劑

硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）購自美國Sigma公司；2-脫氧熒光葡萄糖（2-NBDG，2-[N-（7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazo l- 4- yl）amino]-2-deoxy-D-glucose） 購自Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 8～10周的雄性KK/Upj-Ay/J小鼠隨機分為MS+NaHS組和MS組，每組各6只。MS+NaHS組每日每只腹腔注射0.25 mL H2S供體NaHS（78 μmol/kg）；MS組每日每只注射等量生理鹽水。取同周齡健康雄性C57BL/6J小鼠10只作為正常對照組（CON組），注射等量生理鹽水。連續(xù)給藥4周。

1.3.2 空腹血糖和胰島素的測定 小鼠尾尖取血，強生ONE TOUCH Ultra血糖儀測定血糖值。胰島素測定由總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所采用放射免疫分析法完成。

1.3.3 肥胖指標和血脂的測定 取材前腹腔注射4%水合氯醛麻醉（0.8 mL/100 g），測量體重、腹圍和體長并計算Lee指數(shù)。體長即小鼠麻醉后仰臥，從鼻尖到的長度。Lee's指數(shù)=[體質(zhì)量（g）]1/3/體長（cm）×1000。取腎周、腸系膜、附睪處脂肪稱重并計算脂肪系數(shù)（VFC）。VFC（%）=內(nèi)臟脂肪濕重（viceral fat mass，VFM）/體重（BW）。做頸總動脈插管取血，EDTA抗凝，1500 r/min離心10 min， 取上清液分裝入凍存管中，-80℃保存，全自動生化分析儀測定血脂各項指標。

1.3.4 2-NBDG攝取實驗[6] 將小鼠C2C12骨骼肌細胞株采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)95%空氣5% CO2 37℃恒溫培養(yǎng)，取同批單層培養(yǎng)細胞吸去原培養(yǎng)液后，用無血清培養(yǎng)基饑餓24 h，換用含5%新生牛血清的培養(yǎng)基，取同批單層培養(yǎng)細胞分為A、B、C、D、E 5組，分別加入不同濃度的NaHS（0、50、100、200、400 mmol/L），培養(yǎng)1 h后，棄去培養(yǎng)液，0.01 mol/L PBS沖洗3遍，加入200 μmol/L 2-N BDG培養(yǎng)20 min 后，棄去2- NBDG液，0.01 mol/L PBS 沖洗3 遍，將玻片小心取出，放置在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長540 nm，可觀察到細胞內(nèi)有綠色熒光。各濃度NaHS組選3個皿，每皿隨機選取6個視野拍照，實驗重復(fù)3次，用Imagepro Plus 6.0軟件對熒光積分光密度（IA）進行統(tǒng)計分析。

1.3.5 小鼠NIT-1細胞胰島素分泌功能的測定[7] 采用DMEM培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)95%空氣5% CO2 37℃恒溫培養(yǎng)。取同批單層培養(yǎng)細胞分別加入不同濃度NaHS（0、50、100、200、400 mmol/L），培養(yǎng)1 h后棄去培養(yǎng)液，用含5.6 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h留取培養(yǎng)液，-20℃貯存，待測胰島素含量。然后行葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗，每個皿棄去培養(yǎng)液后加入含16.7 mmol/L 葡萄糖的KRBB 液刺激1 h后，留取培養(yǎng)液，待測胰島素含量。

1.3.6 MS診斷標準 采用2005年4月國際糖尿病聯(lián)盟（International Dabetes Federation，IDF）頒布的MS國際統(tǒng)一診斷標準，即在中心性肥胖基礎(chǔ)上具備以下4項中的任何2項：三酰甘油水平升高，高密度脂蛋白膽固醇水平降低，血壓升高，空腹血糖升高[8]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MS模型的評價

與CON組小鼠相比，KK/Upj-Ay/J小鼠的肥胖指標：腹圍和Lee's指數(shù)顯著增加；空腹血糖和胰島素水平分別增高236.9%和310.3%（P < 0.01）；血脂指標中總膽固醇升高131%，三酰甘油升高141%，低密度脂蛋白膽固醇升高76%，高密度脂蛋白膽固醇水平升高160%（均P < 0.01）（表1），符合MS診斷標準，說明MS模型選擇成功。

2.2 NaHS對血糖和血胰島素水平的影響

給予NaHS 4周后，MS+NaHS組小鼠空腹血糖和胰島素比MS組分別降低了24.2%和46.98%（P < 0.05），提示NaHS可以改善MS的的高糖高胰島素水平。見表2。

2.3 NaHS對骨骼肌細胞攝取2-NBDG的影響

加入2-NBDG 20 min后，熒光顯微鏡下觀察可見，不同濃度NaHS干預(yù)后，骨骼肌攝取2-NBDG增加，熒光IA值C、D組與A組比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），B、E組與A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），其由大到小排序依次為C組>D組>B組>E組>A組。NaHS濃度為100 mmol/L時，骨骼肌攝取葡萄糖量達到最大值。見圖1、2。

A、B、C、D、E即為A、B、C、D、E組，其NaHS濃度分別為0、50、100、200、400 mmol/L

圖1 C2C12細胞對2-NBDG的攝?。ā?0）

A、B、C、D、E組的NaHS濃度分別為0、50、100、200、400 mmol/L；與A組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

圖2 各組2-NBDG攝取的IA值比較

2.4 NaHS對NIT-1細胞胰島素分泌功能的影響

在低糖（5.6 mmol/L葡萄糖）刺激下，不同濃度NaHS對胰島細胞胰島素分泌水平無明顯影響。在高糖（16.7 mmol/L葡萄糖）刺激下，不同濃度NaHS干預(yù)后，胰島素分泌水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），且隨著NaHS水平的升高，胰島素分泌水平下降越明顯。見表3。

表3 不同濃度NaHS對NIT-1細胞胰島素分泌的影響（x±s）

注：與NaHS 0 mmol/L比較，*P < 0.05

3 討論

與CON組相比，KK/Upj-Ay/J小鼠的肥胖指標體重、腹圍、Lee's指數(shù)和空腹血糖、胰島素以及三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇均顯著升高（P < 0.01），這與MS診斷標準相符，說明本實驗選用的MS模型是成功的。

近年來，H2S在胰島素抵抗及糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到人們關(guān)注。在本實驗中MS組小鼠空腹血糖和胰島素水平均比CON組顯著升高（P < 0.05），而給予NaHS 4周后，MS+NaHS組小鼠血糖和胰島素分別比MS組降低了24.2%和46.98%。推測H2S可能是通過增加胰島素靶器官對葡萄糖的攝取和利用來達到降低血糖的作用。因此，本研究進一步觀察了NaHS對骨骼肌細胞葡萄糖攝取量的影響，結(jié)果表明，不同濃度的NaHS干預(yù)后，骨骼肌攝取葡萄糖增加（均P < 0.05），NaHS濃度為100 mmol/L時，骨骼肌攝取葡萄糖量達到最大值。表明H2S可以通過提高胰島素敏感性，促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取來降低血糖。

高胰島素血癥是在胰島素抵抗的狀態(tài)下，胰島B細胞代償性分泌胰島素增加的結(jié)果，不僅會導(dǎo)致胰島B細胞功能的下降，還會損傷血管內(nèi)皮細胞，加速冠狀動脈粥樣硬化形成，導(dǎo)致左心室肥厚[9]，是冠心病、高血壓、高血脂、Ⅱ型糖尿病、肥胖、腦卒中等共同的發(fā)病基礎(chǔ)。研究表明，不同濃度的H2S對胰島B細胞具有不同作用，低濃度的H2S可通過ATP敏感性K通道（KATP）和不依賴于KATP通道的其他機制抑制胰島素釋放，高濃度的H2S可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路導(dǎo)致胰島B細胞壞死[3，10]。本實驗結(jié)果表明，外源性給予NaHS后，小鼠血清胰島素水平均比MS組降低（P < 0.05），NIT-1細胞在加入NaHS后，胰島素分泌水平下降（P < 0.05），且隨著外源性NaHS濃度的增加，胰島素分泌下降越明顯，說明外源性NaHS還可以抑制MS的高胰島素分泌。

綜上所述，H2S可以通過提高胰島素敏感性，促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取來降低血糖，從而改善了高血糖刺激高胰島素血癥發(fā)展的惡性循環(huán)，抑制胰島素分泌；同時，H2S在高糖條件下可以直接抑制胰島素分泌，改善了MS小鼠的高胰島素狀態(tài)。另外，H2S還作為體內(nèi)的“調(diào)停器”減輕高糖環(huán)境對胰島細胞造成的損害[11]。因此，外源性H2S可能通過多個方面在MS小鼠中發(fā)揮血糖調(diào)節(jié)的重要作用。

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第6篇：代寫情書范文

[關(guān)鍵詞] 肺炎支原體； 代謝組學(xué)； 超高效液相色譜飛行時g質(zhì)譜； 模式識別

Serum metabonomics in mice infected with mycoplasma

pneumoniae by UPLCQTOFMS

WEI Wenfeng， CHU Yantao， LIU Ye， HUO Jinhai， WANG Weiming*

（Heilongjiang Academy of Chinese Medical Sciences， Harbin 150036， China）

[Abstract] Ultra high performance liquid chromatography coupled with tandem quadrupole time of flight mass spectrometry（UPLCQTOFMS） was applied to metabonomics study in BALB/c mice infected with mycoplasma pneumoniae（MP） to analyze the changes in serum endogenous metabolites， identify potential biomarkers associated with mycoplasma pneumoniae pneumonia（MPP）， analyze the metabolic pathway and explore the pathogenic mechanism of MPP. The BALB/c mice were inoculated with MP by repeated intranasal infectious routes to establish MPP models， and the results of the lung tissue biopsy， IgM and mycoplasma nucleic acid content determination showed that the models of MP in BALB/c mice were successfully established. UPLCQTOFMS was used to analyze the serum metabolic profiling of BALB/c mice infected with MP， and then principal component analysis（PCA） was combined with orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLSDA） for data processing. The results showed that there were significant differences in serum metabolic profile between the MP infected mice and the normal mice. Fortyseven potential biomarkers such as ornithine， cortisol， vitamin A and tryptophan were screened out by database searching and MS information matching. These potential biomarkers related to 17 metabolic pathways including retinol metabolism， arginine and proline metabolism， steroid hormone synthesis and so on. The metabonomic research method for serum of mice infected with mycoplasma pneumoniae based on UPLCQTOFMS was established in this study. The metabolic changes of endogenous small molecules in mice infected with MP were reflected in the overall level， laying the foundation for the selection and evaluation of MPP drugs.

[Key words] mycoplasma pneumonia； metabolomics； ultraperformance liquid chromatography coupled with quadrupole timeofflight mass spectrometry； pattern recognition

肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，MP）是引起呼吸道疾病和全身性病變的重要致病菌之一，可引起肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）。它是學(xué)齡前兒童和青少年時期最常見的肺炎之一，發(fā)病率為19.6%～21.9%，呈逐年增加趨勢[1]。小兒肺結(jié)構(gòu)發(fā)育不完善，經(jīng)過反復(fù)感染后，極易受損。MP主要通過飛沫傳播，引起上呼吸道和肺部感染，同時引起腦炎、 心肌炎、 肝炎、 關(guān)節(jié)炎等肺外組織或器官的病變。臨床表現(xiàn)多種多樣，嚴重時出現(xiàn)暴發(fā)型肺炎，發(fā)展迅速，最終因呼吸衰竭而死亡[2]。

MPP臨床檢測主要利用病原體培養(yǎng)法和血清學(xué)檢測確證。病原學(xué)檢測結(jié)果陽性率低，病原體培養(yǎng)結(jié)果明顯滯后，并且每種診斷都有其局限性，臨床上常采用多種檢測手段聯(lián)合應(yīng)用的方式，但是仍有高達40%～50%的社區(qū)獲得性肺炎不能確定相關(guān)病原體，嚴重影響早期的抗菌藥物選擇[3]。代謝組學(xué)從整體觀出發(fā)，以機體代謝物組變化為載體，以時空動態(tài)性和全局性觀點，試圖全面解析疾病對機體的影響[4]。代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在實驗動物模型評價中展現(xiàn)了其特色和優(yōu)勢[56]，但目前關(guān)于支原體肺炎代謝組學(xué)的研究尚未見報道。

本研究利用代謝組學(xué)研究方法，以MP感染小鼠血清為研究對象，采用UPLCQTOF 液質(zhì)分析，并通過化學(xué)計量學(xué)模式識別的方法，發(fā)現(xiàn)潛在的生物標志物（potential biomaker）并鑒定，解析代謝通路。從代謝組學(xué)角度闡明MPP的致病機制，為其有效防治提供新理論，促進治療MPP藥物的篩選和開發(fā)。

1 材料

ACQUITYTM UPLC液相色譜儀（美國Waters公司）；Sciex 5600+型質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）；IKA MS3 digital渦旋振蕩器（廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司）；DH5000型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒儀器有限公司）；LDZX75KB型立式蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；DLCJ1N型超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；ST16R型高速低溫離心機（美國賽默飛世爾科技有限公司）。

肺炎支原體國際標準菌株FH（ATCC15531，美國菌種保藏中心）；PPLO培養(yǎng)基（碧迪醫(yī)療器械有限公司）；乙醚（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；核酸定量檢測試劑盒（廣州中山大學(xué)達安基因股份有限公司）；甲醇（色譜級，Merck公司）；乙腈（色譜級，Merck公司）；甲酸（色譜級，Thermo Scientific）；屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

BALB/c雄性小鼠20只，SPF級，體重（20±2）g，北京維通利華實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（京）2012001。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥科學(xué)院動物實驗中心，環(huán)境溫度 （20±2） ℃，相對濕度 （50±20）%。

2 方法

2.1 支原體培養(yǎng)與造模方法 支原體培養(yǎng)參見文獻[7]。小鼠支原體肺炎模型采用支原體滴鼻感染方法，將20只BALB/c小鼠隨機分為空白組和模型組，每組10只，乙醚麻醉，模型組取MP培養(yǎng)液20 μL緩慢滴入BALB/c小鼠鼻孔內(nèi)，每日1次，連續(xù)感染3 d?？瞻捉M給予無MP的培養(yǎng)液。

2.2 樣品采集與預(yù)處理 小鼠于造模結(jié)束后24 h采集穎荊采集前禁食12 h，各組由眼眶取血，血液靜置1 h后于3 000 r?min-1離心10 min取血清，-80 ℃凍存。取血后處死小鼠，剪取左肺組織10%甲醛固定，用以病理切片觀察；剪取右肺組織用于支原體核酸定量檢測。

HE 染色實驗：取甲醛固定的肺組織，用乙醇梯度脫水，二甲苯透明2 次，放入石蠟內(nèi)進行包埋。蠟塊修好后固定于石蠟切片機上切片，將完全展開的蠟片貼附于清潔載玻片上，常規(guī)HE 染色，在顯微鏡下進行MP 特異性病變間質(zhì)性肺炎的病理組織學(xué)檢查。

血清IgMMP測定：取各組血清樣品，同時設(shè)定對照孔和標準樣品孔，每孔加入50 μL樣品，50 μL IgM結(jié)合物，室溫孵育1 h，洗去孔內(nèi)液體，加入100 μL底物，室溫孵育30 min，加入100 μL終止液，于450 nm下讀取吸光度值。

支原體核酸含量測定：取肺組織100 mg加入100 μL純水，勻漿，吸取20 μL，加入等量DNA提取液，100 ℃保溫10 min，8 000 r?min-1離心5 min，取上清液2 μL用于測定，同時設(shè)立標準曲線樣本、質(zhì)控樣本，測試方法參照試劑盒說明書設(shè)定相關(guān)程序。

代謝組學(xué)樣本測定：每個樣本取100 μL血清，加400 μL甲醇，渦旋30 s，4 ℃條件下13 000 r?min-1離心10 min，取上清液用于代謝組學(xué)分析。

2.3 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相0.1%甲酸水（A）0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫，0～3 min，95%～40%A，3～4 min，40%A，4～9 min，40%～0%A，流速0.3 mL?min-1； 柱溫50 ℃；樣品倉溫度4 ℃；進樣量3 μL；色譜儀流出液不分流直接注入質(zhì)譜儀進行正負離子掃描檢測。

2.4 質(zhì)譜條件 采用ESI離子源，離子化模式為電噴霧正、負離子模式，正離子掃描模式參數(shù)：離子源電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣55 psi（1 psi=6.895 kPa）；輔助氣55 psi；氣簾氣35 psi；去簇電壓80 V；碰撞能量35 eV；碰撞能量擴展15 eV；TOFMS掃描范圍80～1 500；Product Ion掃描范圍50～1 500。掃描方式：IDA設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps的8個最高峰進行二級質(zhì)譜掃描，并開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。Analyst TF 1.6 software采集工作站；采用AB Sciex公司的CDS質(zhì)量校正系統(tǒng)在線校正。負離子掃描模式：離子源電壓-4 500 V；去簇電壓（DP）-80 V；碰撞能量（CE）-35 eV；其余參數(shù)同正離子掃描模式。

2.5 數(shù)據(jù)處理 將所有生物樣本的UPLCMS數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarKerview軟件，進行峰匹配、峰對齊、峰提取和歸一化處理，進而進行主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA），并采用正交信號校正技術(shù)過濾變量信息，通過代謝軌跡變化趨勢分析模型組與空白組的差異，確定主成分和潛在生物標志物（Marker）。利用QTOF測定各Marker的精確相對分子質(zhì)量，對所篩查的具有顯著性差異的代謝物進行分析，計算其可能的分子式。再通過分子式檢索Human Metabolome Database（HMDB）數(shù)據(jù)庫，結(jié)合文獻和標準品確證的方式，鑒定潛在生物標志物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過檢索代謝途徑數(shù)據(jù)庫KEGG和MetPA，結(jié)合相關(guān)文獻、生物化學(xué)及分子生物學(xué)知識，探討潛在生物標志物相關(guān)生物學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠肺組織病理變化 小鼠肺組織病理切片評分系統(tǒng)由1 個0～26分的可數(shù)評分組成[8]，5 個分類評價系統(tǒng)由管腔周圍浸潤而致的細支氣管和支氣管數(shù)目、管腔周圍浸潤的程度、管腔內(nèi)滲出的嚴重度、血管周圍浸潤的頻度、實質(zhì)性肺炎的嚴重度合并后記分，每張切片選擇5 個視野評分?？瞻捉M支氣管、肺泡、血管等無明顯病變，上皮細胞狀態(tài)良好，肺組織中未見炎性細胞浸潤；模型組支氣管中度改變，官腔有大量分泌物，肺泡上皮壞死，彌漫性細胞浸潤，邊緣模糊，病變面積較大，肺泡腔內(nèi)伴以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，嚴重者伴有紅細胞滲入（表1，圖1）。

3.2 血清IgM與MP核酸定量 與空白組相比，模型組血清IgM含量極顯著升高（P

3.3 小鼠血清代謝組學(xué)分析 采用UPLCMS進行血清樣本的分離與數(shù)據(jù)采集，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarkerView軟件進行PCA無監(jiān)督分析（圖4），在正離子2個主成分（PC1：82.2；PC2：4.6）和負離子2個主成分（PC1：56.1；PC2：11.2）構(gòu)建的得分圖可直觀看出，空白組與模型組有顯著分開趨勢。為進一步區(qū)分不同組別差異，對2組血清代謝物進行有監(jiān)督的OPLSDA分析（圖5），正離子模式的模型參數(shù)為R2=0.959 5，Q2=0.880 9，負離子模型參數(shù)為R2=0.986 2，Q2=0.961 4，參數(shù)顯示所構(gòu)建模型有效，可用于后續(xù)組間差異成分的尋找及分析。結(jié)合MarkerView軟件中t檢驗包篩選在2組中有顯著性差異（P1.5倍，篩選出對分型貢獻較大且具有顯著性差異的離子作為潛在的生物標志物進行分析鑒定（圖6）。

3.4 MPP潛在生物標志物鑒定 潛在標志物的鑒定方法為通過一級質(zhì)譜信息確定相對分子量， 利用二級質(zhì)譜信息獲得其結(jié)構(gòu)碎片信息。通過HMDB，KEGG，METLIN等多個數(shù)據(jù)庫檢索，共推斷出47個生物標志物，并列舉了各生物標志物在空白組和模型組中的表達水平。與空白組相比，模型組代謝物水平升高的有20種，降低的有27種（表2）。

3.5 代謝通路分析 應(yīng)用MetPA網(wǎng)站構(gòu)建分析代謝通路，并選擇小鼠物種，將推斷的47個代謝物的HMDB編號輸入進行代謝通路分析（圖7）。利用拓撲分析，代謝通路影響的臨界值設(shè)置為0.01，大于這個值將選擇作榍痹詰墓丶代謝通路（表3）。與支原體肺炎相關(guān)的代謝通路共涉及視黃醇代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、甾類激素合成、色氨酸代謝、嘌呤代謝等17個代謝途徑。

3.6 生物標志物與生化病理指標的相關(guān)性分析 選取OPLSDA中Fold Change>2的差異變量化合物與IgM含量、MP含量及病理切片中病變面積總分進行相關(guān)性分析，找出代謝物與病理生化指標的相關(guān)性并列出相關(guān)系數(shù)（表4）。結(jié)果表明，5羥吲哚乙酸、2氨基辛酸、賴氨酸、L色氨酸與MP含量有極度相關(guān)性，D2羥谷氨酸、賴氨酸、L色氨酸、對甲酚與病理面積總分有極度相關(guān)性，D2羥谷氨酸、2氨基辛酸、賴氨酸與IgM含量極度相關(guān)。

4 討論

經(jīng)前期實驗摸索，本研究從生化指標和肺組織病理指標判斷，MPP模型動物造模成功，進一步利用代謝組學(xué)方法結(jié)合UPLCQTOFMS技術(shù)，研究MPP小鼠血清內(nèi)源性代謝物的變化規(guī)律。本課題組已熟練掌握肺炎支原體培養(yǎng)、測定及滴鼻感染小鼠的造模方法[8]，經(jīng)前期實驗摸索確定了肺炎支原體感染小鼠的劑量。在UPLCQTOFMS測定中，每間隔5個樣品進樣1個QC樣品，選取QC樣品中不同保留時間段內(nèi)響應(yīng)值高的5個化合物質(zhì)控分析，選取化合物的保留時間及峰面積的RSD均小于1.0%，保證此評價方法的可靠性。利用模式識別的數(shù)據(jù)處理方式初步判定47個生物標志物，發(fā)現(xiàn)其中對正常組和模型組區(qū)分貢獻較大的代謝物涉及了17條代謝通路。

維生素A（VA）涉及到視黃醇代謝，對維持視覺并促進機體生長發(fā)育有重要作用，另外可以增強機體的免疫反應(yīng)[9]。VA的缺乏可引起氣管、支氣管上皮細胞發(fā)育受阻，細胞脫落，氣道上皮完整性遭到破壞。本研究中，模型組VA水平降低，提示MPP可引起VA水平下降，進而導(dǎo)致氣道上皮完整性的破壞和機體免疫功能下降。

鳥氨酸和乙酰氨基丁酸涉及精氨酸和脯氨酸代謝，本研究中模型組小鼠的鳥氨酸水平降低，鳥氨酸轉(zhuǎn)化作用增強，乙酰氨基丁酸水平降低，說明聚肽類進一步轉(zhuǎn)化的作用下降，提示腐胺等聚肽類水平升高，直接或間接影響細胞的pH[10]。文獻報道，在小鼠哮喘模型的肺組織中聚肽類水平有所增加。同時因為VA的缺乏，氣道上皮的損傷和脫落，炎性細胞的浸潤等，氣道壁結(jié)構(gòu)易發(fā)生改變，氣道動力出現(xiàn)滯緩，在一定程度上導(dǎo)致了支原體肺炎患者的哮喘癥狀。

色氨酸涉及色氨酸代謝，體內(nèi)氨基酸作為蛋白質(zhì)合成原料及分解代謝產(chǎn)物，參與多種生理和病理過程，其水平的高低往往可以反映機體的代謝情況。色氨酸是人體必需氨基酸之一，在肝臟以外，色氨酸主要通過降解為犬尿氨酸進行代謝，該過程受吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）影響，IDO是色氨酸犬尿氨酸轉(zhuǎn)化途徑的限速酶，炎癥因子干擾素γ（IFNγ）是其誘導(dǎo)劑[11]。本研究中，模型組色氨酸水平降低，加速了色氨酸犬尿氨酸途徑，提示機體炎癥明顯。

次黃嘌呤和尿酸涉及嘌呤代謝，嘌呤是動物基因結(jié)構(gòu)的一部分，在機體中起著代謝調(diào)節(jié)、能量供應(yīng)等重要作用。次黃嘌呤和尿酸是腺嘌呤和鳥嘌呤的代謝產(chǎn)物，其中，次黃嘌呤來自一磷酸腺苷的分解代謝，該過程受氧氣含量影響較大，缺氧時，一磷酸腺苷會加速分解，導(dǎo)致次黃嘌呤含量在血中增加[12]。本研究中，模型組次黃嘌呤和尿酸含量升高，可能由于肺組織充血、水腫等，導(dǎo)致氣管和支氣管管壁增厚，管腔變得狹窄，進而影響通氣，同時肺泡腔因為滲出阻礙氣體交換，從而引起缺氧環(huán)境而致。

綜上所述本研究采用UPLCQTOFMS技術(shù)結(jié)合模式識別數(shù)據(jù)分析手段，進行了小鼠支原體肺炎的血清代謝組學(xué)研究。共標識了47種生物標志物，并且呈現(xiàn)一定的上調(diào)或下調(diào)趨勢，這些生物標志物涉及17條代謝通路，其中視黃醇代謝、精氨酸與脯氨酸代謝、甾類激素合成等代謝途徑與肺組織損傷、炎癥反應(yīng)、免疫抑制有密切關(guān)聯(lián)。本研究從整體水映了支原體肺炎內(nèi)源性小分子的代謝變化，有助于MPP代謝網(wǎng)絡(luò)的全面構(gòu)建及疾病診斷，為抗MPP藥物的選擇與評價奠定了基礎(chǔ)。

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